厭氧氨氧化-羥基磷灰石（Anammox-HAP）耦合工藝是一種將Anammox和誘導結晶相結合的污水處理方法，它首先通過“生物誘導礦化”的方式將污水中的PO43-和Ca2+結合成羥基磷灰石，然后使HAP與厭氧氨氧化菌（AnAOB）結合成AnammoxHAP，從而實現同步脫氮除磷的目的。此外，AnAOB在耦合體形成過程中可分泌胞外聚合物（EPS）等內源有機質，該物質可起到橋梁作用將生物質與HAP黏結到一起，進一步促進了耦合體的形成。Anammox-HAP耦合工藝既可實現同步脫氮除磷的目的，又可將磷酸鹽（PO43--P）以HAP的形式儲存在剩余污泥中，最終實現磷的回收和利用。
溫度是影響厭氧氨氧化工藝的重要因素之一，保持適宜的溫度對微生物的生長和新陳代謝至關重要。溫度降低會抑制AnAOB的生長，使其豐度下降，進而影響工藝的脫氮性能，因此，控制合適的溫度有利于Anammox反應器高效、穩定地運行。研究表明，Anammox反應的最適溫度為30~40℃，然而，由于污水溫度的季節性變化，大多數地區的污水溫度低于25℃，對于高緯度地區，污水溫度通常在10℃以下，若不對污水溫度加以控制，很難達到Anammox反應的最適溫度，從而導致其脫氮性能下降。
研究者考察了中低溫條件下不同反應器中Anammox的性能，DeAlmeida等人發現，當溫度為35℃或25℃時，SBR反應器對NH4+-N和NO2--N的去除率高達96%，而在20℃時去除率雖出現下降，但依然可保持在90%左右；Ye等人發現，28℃時，對生物膜載體進行預曝氣有利于提高厭氧附著膜膨脹床（AAFEB）反應器的脫氮性能；Dosta等人在18~30℃下成功運行了SBR反應器，但當溫度降至15℃時，NO2--N開始大量積累，Anammox脫氮能力明顯下降；Wang等人也有類似發現，當水溫由35℃降至15℃時，UASB反應器出水中的NO2--N濃度突然增加。Zhu等人認為，Anammox反應的最佳溫度為26~28℃，當溫度高于40℃或低于15℃時都會抑制AnAOB的代謝速率。但目前對于Anammox-HAP系統在中低溫下的運行性能了解不多，限制了該工藝的應用和推廣。
為此，采用AAFEB反應器考察了AnammoxHAP系統在中低溫條件下的脫氮除磷性能，同時分析污泥粒徑、EPS和微生物菌群結構變化，研究中低溫對系統脫氮性能的影響及機制，評估了反應器不同位置的AnAOB富集情況，以期為該耦合工藝的實際應用提供指導。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置與運行策略
接種污泥取自實驗室穩定運行的AAFEB反應器，運行溫度為35℃，水力停留時間（HRT）為3h，顆粒污泥呈紅褐色。實驗采用一個總容積為10L、有效容積為6.28L、內徑為10cm的AAFEB反應器（見圖1），反應器內為Anammox-HAP系統，已經在（30±1）℃下穩定運行了110d。反應器采用有機玻璃制作。整個系統除了AAFEB反應器外，還設有進水桶、出水桶、恒溫箱、蠕動泵和濕式氣體流量計等設備。模擬污水從反應器底部進入，經過充分反應后從頂端的出水口排出。
反應器主體部分設有恒溫層，通過恒溫箱控制反應器內污水溫度。表1為反應器的運行階段和進水特性，共分為4個階段。階段Ⅰ~Ⅳ的溫度逐漸降低，HRT保持3h不變，pH維持在7.5~8.5之間。
1.2 原水水質
反應器采用人工模擬污水，分別由（NH4）2SO4、NaNO2和KH2PO4提供NH4+-N、NO2--N和PO43--P，其中，NH4+-N與NO2--N物質的量之比為1∶1.32；此外，還投加了NaHCO（31.26g/L）、CaCl2‧2H2O（0.45g/L）、KCl（0.57g/L）和MgSO4‧7H2O（0.2g/L）。
在配制污水時，還投加了微量元素Ⅰ和Ⅱ，投加量均為1mL/L。其中，微量元素Ⅰ包括：EDTA（5g/L）、FeSO4‧7H2O（5g/L）；微量元素Ⅱ包括：EDTA（15g/L）、ZnSO4‧7H2O（0.43g/L）、CoCl2‧2H2O（0.24g/L）、MnCl2‧4H2O（0.99g/L）、CuSO4‧2H2O（0.25g/L）、NiCl2‧3H2O（0.19g/L）、NaSeO4‧10H2O（0.21g/L）、H3BO（30.014g/L）、NaMoO4‧2H2O（0.22g/L）。
1.3 檢測指標與分析方法
每天取1次反應器進出水，采用標準方法檢測NO3--N、NH4+-N、NO2--N和PO43--P。通過加熱稱重法和馬福爐燃燒減重法檢測混合液懸浮固體濃度（SS）和混合液揮發性懸浮固體濃度（VSS）。采用“加熱法”提取污泥中的EPS，然后分別通過苯酚-硫酸法和Folin-酚法檢測多糖和蛋白質含量。同時，通過Mastersizer2000型激光粒度儀對Anammox顆粒污泥的粒徑分布進行測定。總氮容積負荷（NLR）、總氮去除負荷（NRR）和總氮去除率（NRE）由進出水TN濃度等通過計算得到。
利用高通量測序技術對AAFEB反應器內微生物的菌群變化進行分析。對細菌的16SrRNA基因的V3-V4區域進行PCR擴增，引物序列為341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。在97%的相似水平下對所有序列進行OTUs劃分，并進行統計分析。測序是在上海生工生物工程股份有限公司的IlluminaMiSeqPE300平臺上進行的。
2、結果與討論
2.1 溫度降低過程中系統的脫氮除磷情況
在降溫過程中，Anammox-HAP耦合工藝脫氮除磷性能的變化見圖2。在階段Ⅰ控制系統溫度為30℃，在NRE保持相對穩定下，每10d改變進水NH4+-N濃度，進水NH4+-N濃度的提高導致NLR由最初的（2.30±0.07）kg/（m3·d）增至（3.58±0.08）kg/（m3·d）。此階段對氮的去除效果較好，NRE基本維持在80%~85%之間，NRR最高可達（2.95±0.09）kg/（m3·d），表明AnAOB的活性較高。
在階段Ⅱ，保持進水氮濃度不變，水溫由30℃降低至25℃。降溫對系統脫氮性能產生了一定的影響，NRE雖然保持在75%以上，但與階段Ⅰ相比，NRR由（2.95±0.09）kg/（m3·d）降低至（2.69±0.14）kg/（m3·d），說明當水溫由30℃降為25℃時，AnAOB活性受溫度變化影響較小。然而，降溫對磷的去除效果影響較大，去除率由之前的75%左右降至50%左右，說明HAP的形成受降溫的影響較大，25℃不利于該系統除磷。
在階段Ⅲ水溫降至20℃后，反應器對氮的去除效果明顯變差，與階段Ⅱ相比，NRE與NRR均明顯下降，分別降至65%和（2.25±0.07）kg/（m3·d）。表明低溫抑制了AnAOB的活性，導致Anammox脫氮能力降低，反應器出水NH4+-N、NO2--N濃度分別為50和80mg/L左右，均出現了積累。有研究發現，高濃度的NH4+-N和NO2--N對微生物有毒害作用，分別會以游離氨（FA）和游離亞硝酸（FNA）的形式抑制AnAOB的活性，特別是FNA對Anammox反應的抑制更為顯著。因此，經過15d的運行后，主動降低進水基質（NH4+-N和NO2- N）濃度，以防止FA和FNA太高而對系統造成嚴重影響。然而，系統脫氮性能并沒有得到明顯改善。為進一步緩解高濃度基質給系統帶來的不利影響，6d后將進水NH4+-N濃度由150mg/L下降至120mg/L，NO2--N濃度也按比例降低。穩定運行一段時間后，系統NRE提高，但其脫氮效率仍然低于降溫前。同時，由于進水氮濃度的降低導致系統的NRR明顯下降，由之前的（2.25±0.07）kg/（m3·d）降至（1.61±0.07）kg/（m3·d）。在階段Ⅲ后期，繼續降低進水基質濃度，NO2--N積累的問題得到一定程度緩解。
在階段Ⅳ降低溫度至15℃，系統脫氮能力繼續下降，NRE在短時間內由之前的65%降至50%。同時，NRR由之前的（1.61±0.07）kg/（m3·d）降低至（1.14±0.02）kg/（m3·d）。且系統脫氮性能在反應器連續運行4d后并未明顯改善。此時，反應器出水中的氮濃度明顯上升，因此進一步降低進水NH4+-N至50mg/L，NO2--N降低至66mg/L。在進水氮濃度降低后，系統的脫氮性能先是出現短暫的回升，而后又下降至55%左右，且穩定了一段時間。在第117天時，系統的氮去除性能突然惡化，NRE由前一天的55%下降至38%，而后在第118天時下降至23%，NRR由之前的（0.56±0.05）kg/（m3·d）降低至（0.23±0.06）kg/（m3·d）。說明AnAOB的活性受到嚴重抑制，系統脫氮性能惡化。溫度的降低對系統除磷性能的影響也很大，當水溫降至15℃時，出水磷濃度不斷上升，去除率由階段Ⅳ初期的48.4%逐漸降低至15.9%。在較低溫度下，結晶反應的飽和指數下降，導致HAP的形成更加困難，說明生物誘導結晶法除磷在15℃下受限。
2.2 降溫過程中污泥特性的變化
EPS是一種由微生物分泌且通常位于細胞表面的生物聚合物，其成分較為復雜，主要包含多糖（PS）、蛋白質（PN）、腐殖酸、核酸和脂質等物質，其中PS和PN占主要部分。圖3為系統降溫過程中微生物分泌的EPS總量和組成的變化情況。當溫度為20~30℃時，微生物分泌的EPS總量差別不大，基本維持在90mg/gVSS上下。
產量較高的EPS可降低Anammox顆粒污泥的孔隙率和滲透率，有利于微生物的聚集，從而緩解低溫對微生物活性的不利影響。與PS相比，PN中含有更多帶負電荷的氨基酸，該物質更容易與多價陽離子發生靜電結合，因此，PN更有利于提高細菌聚集體結構的穩定性。而存在于菌膠團細胞間隙中的PS不僅有利于微生物的聚集，還有利于保持顆粒污泥結構的完整性。
當溫度降至15℃時，由于AnAOB的活性受到明顯的抑制，EPS產量顯著降低，由之前的96.79mg/gVSS降為67.10mg/gVSS。EPS產量的降低不利于顆粒污泥生長，也不利于Anammox系統穩定高效地脫氮。此外，PN是疏水性物質，而PS是親水性物質，PN/PS常用來表征污泥表面的疏水性，同時對維持微生物群落結構的完整性具有重要作用。研究表明，較大的PN/PS值有助于促進污泥顆粒化，故當溫度為25~30℃時更有利于形成顆粒污泥。
對AAFEB反應器內不同高度的污泥平均粒徑進行了分析，結果如圖4所示。在Anammox-HAP耦合脫氮除磷系統中，耦合體主要是由AnAOB和HAP結合而成，而HAP的密度較大，沉降性較好，大多數HAP位于反應器的底部；同時，由于AAFEB反應器采用“底部進水”方式，中部、底部污泥因最先與基質接觸而保持了較高的活性，從而分泌了更多的EPS。因此，中部和底部污泥的粒徑最大。
一般認為，EPS可增強顆粒污泥結構的穩定性，還充當微生物和HAP的“橋梁”，將AnAOB和HAP黏結起來，這有利于顆粒污泥的形成和平均粒徑的增大。由于中部和底部污泥中存在大量的HAP，且AnAOB活性較高，分泌的EPS更多，AnAOB和HAP在“生物誘導礦化”和“生物控制礦化”的共同作用下不斷聚集成團，從而使中部和底部的污泥擁有更大的平均粒徑；而上部的污泥由于得不到充足的HAP和EPS，因此平均粒徑較小。
對比不同溫度下的污泥平均粒徑可以發現，30℃下不同高度污泥的平均粒徑均較大，且該溫度下前后期顆粒污泥平均粒徑較為穩定；當溫度降至25℃時，污泥粒徑由于突然的降溫而減小，但隨著反應器的穩定運行，微生物對溫度逐漸適應，污泥的平均粒徑逐漸恢復至降溫前的水平；當溫度降為20℃時，污泥平均粒徑的變化趨勢與25℃時類似，先減小后增大；當溫度降為15℃時，AnAOB的活性受到抑制，EPS產量明顯減少，部分顆粒污泥因得不到充足的EPS而發生解體，且即使穩定運行一段時間也無法使粒徑增大。
分別在第10天（30℃末）和第120天（15℃末）從反應器中取出不同高度的Anammox污泥，通過培養皿和刻度尺觀察其形態，結果表明，30℃時的污泥粒徑普遍較大，顆粒狀較為明顯；當溫度降為15℃且運行一段時間后，部分顆粒污泥發生解體，粒徑明顯減小。這表明，降溫會導致EPS產量降低，進而影響污泥顆粒穩定性。
2.3 微生物菌群分析
通過高通量測序技術，對不同溫度下的微生物菌群結構進行檢測。待測污泥樣本共有9份，取自不同溫度、不同高度的Anammox污泥樣本分別命名為：S-25、Z-25、D-25、S-20、Z-20、D-20、S-15、Z-15和D-15，其中，S、Z和D分別代表上部、中部和底部，數字代表溫度。污泥中微生物的序列數、Alpha多樣性指標的測試結果如表2所示。
Coverage反映的是待測樣品中的微生物在樣品文庫中所占的比例，該值越大則數據的可信度越高。由于9個污泥樣本的Coverage值均超過99.5%，因此，樣本序列的被測出概率較高，測序結果完全可以反映污泥樣本中微生物的真實狀況。Simpson和Shannon指數被用來表示微生物菌群的多樣性，一般來說，Simpson指數越大或Shannon指數越小，表明種群多樣性越低。由表2可知，在降溫過程中，反應器內同一高度污泥的微生物多樣性呈現先降低后增加的趨勢，說明雖然低溫會抑制微生物活性，但微生物對低溫的適應能力也在逐漸增強。此外，Ace和Chao指數可表示微生物的相對豐度，在同一溫度下，底部污泥中微生物的相對豐度最高。
圖5顯示了在不同溫度下屬水平微生物的群落組成和相對豐度。共檢測到4種AnAOB，其中unclassified_Candidatus_Brocadiaceae的相對豐度最高，在25℃時，該菌在不同高度污泥中的相對豐度略有差別，從上往下依次為14.6%、15.1%和7.7%。與其他AnAOB屬相比，Candidatus_Anammoxoglobus的相對豐度最低，幾乎檢測不到。當溫度由25℃降低至15℃時，unclassified_Candidatus_Brocadiaceae作為優勢菌，其相對豐度減少，是導致系統脫氮性能不斷下降的原因之一。在降溫期間，與Candidatus_Brocadia相比，Candidatus_Kuenenia的相對豐度基本呈現不斷上升的趨勢，說明該菌對低溫的耐受能力更強。同時還注意到，底部污泥中Candidatus_Kuenenia的相對豐度隨溫度的降低而上升，而上部污泥則呈現相反的變化趨勢，說明在低溫環境下，反應器底部更利于Candidatus_Kuenenia的生長和繁殖。并且高通量測序發現，污泥中存在少量的氨氧化菌（AOB），該菌對脫氮也做出一定的貢獻。
3、結論
①當水溫從30℃梯級降低到15℃過程中，系統脫氮除磷性能均降低。NRR由30℃時的最高值（2.95±0.09）kg/（m3·d）降低至15℃時的最低值（0.23±0.06）kg/（m3·d）；除磷率由75%降至20%。特別是降溫至15℃后，Anammox-HAP耦合工藝的脫氮除磷性能顯著降低，溫度低于15℃不利于該系統脫氮除磷。
②溫度是影響污泥粒徑的重要因素之一，當系統溫度≥20℃時，溫度突然降低會導致AnammoxHAP顆粒污泥粒徑在短時間內變小，但顆粒污泥對低溫表現出來一定的耐受性，隨著系統的穩定運行，其平均粒徑會逐漸恢復至降溫前水平。然而，當溫度降至15℃時，系統脫氮性能在短時間內發生明顯惡化，EPS含量降低，顆粒污泥出現解體。
③在Anammox-HAP耦合系統中，AnAOB是主要的脫氮功能菌。其中，unclassified_Candidatus_Brocadiaceae的相對豐度最高可達15.1%，是耦合系統中的優勢AnAOB屬。與Candidatus_Brocadia相比，Candidatus_Kuenenia對低溫的耐受能力更強，且當環境溫度較低時，Candidatus_Kuenenia更傾向于在反應器底部生存和繁殖。（來源：天津城建大學環境與市政工程學院，天津市水質科學與技術重點實驗室，河北泛亞工程設計有限公司華北分公司）
