1 引言(Introduction)
隨著核電和軍工的快速發(fā)展，世界各國對天然鈾的需求也開始大幅度上升，形成了新一輪的鈾礦開發(fā)熱，然而隨之帶來的問題是鈾礦開采和鈾水冶過程中產(chǎn)生的放射性廢水的數(shù)量和種類也越來越多.我國鈾礦冶放射性廢水具有濃度低、數(shù)量大、污染面積廣等特點，這些廢水含有鈾、釷和鐳等半衰期較長的天然放射性元素，若未經(jīng)處理直接排放，不僅會污染地表水，而且還會慢慢滲入地下，造成地下水的污染，進而擴展到整個生物圈，最終對人和動物造成化學(xué)毒性和輻射毒性兩個方面的危害.因此，鈾污染水體的修復(fù)問題亟待研究解決.
目前，處理鈾污染水體的主要方法有化學(xué)沉淀法、蒸發(fā)濃縮法、吸附法、離子交換法、離子浮選法、膜分離法等.這些傳統(tǒng)的物理化學(xué)處理方法在實際應(yīng)用中存在許多不足，主要表現(xiàn)為工序復(fù)雜，產(chǎn)生的泥漿量較大，還需對二次污染物再次處理，而且在處理低濃度、大面積鈾污染水體時需要較高的費用.生物修復(fù)作為一項新興的高效修復(fù)技術(shù)，特別是植物修復(fù)和微生物修復(fù)逐漸成為近年來國內(nèi)外研究的熱點.生物修復(fù)具有修復(fù)成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點，但單獨采用植物修復(fù)時，存在生產(chǎn)周期長、生物量小、受pH值、SO42-等化學(xué)因素影響較大，且超富集往往具有專一性等缺點;單獨采用微生物修復(fù)時，雖然可以通過改變重金屬的化合價態(tài)來降低毒性并富集重金屬，但需要不斷添加碳源和氮源，且微生物死后被吸附的核素又會重新釋放到水中，造成修復(fù)效率降低.這就要求我們利用植物和微生物的共生或共存關(guān)系構(gòu)建植物-微生物共生富集凈化體系，充分發(fā)揮植物和微生物各自修復(fù)技術(shù)的優(yōu)勢，彌補單一植物或微生物修復(fù)的不足，實現(xiàn)含鈾廢水的高效修復(fù).
滿江紅是一種生長在水田或池塘中的小型浮水植物，常與魚腥藻共生，魚腥藻能固定大氣中的氮氣為滿江紅提供氮源，是一種天然的植物(滿江紅)-微生物(魚腥藻)共生體系.研究表明，滿江紅和魚腥藻形成的共生體系對水中的重金屬離子有較好的富集能力;特別是報道了滿江紅和魚腥藻的共生體系對水體中的鈾具有較好的去除作用.但魚腥藻在滿江紅-魚腥藻共生體系去除水中鈾時的作用尚未開展相關(guān)研究.因此，本文擬分離滿江紅和魚腥藻，培育出無藻滿江紅和魚腥藻，研究無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻對水中鈾的去除效果，并通過紅外光譜技術(shù)分析無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻富集鈾前后化學(xué)基團的變化，以揭示魚腥藻在滿江紅-魚腥藻共生體系去除水中鈾時的作用，為建立新的植物-微生物共生富集凈化體系提供理論依據(jù).
2 材料與方法(Materials and methods) 2.1 無藻滿江紅的獲取
在湖南省衡陽市郊外采集回野生滿江紅(Azolla anabaena)，即天然的滿江紅-魚腥藻共生體系，先用自來水沖洗3~5 min，放入改良的Hoagland培養(yǎng)液中進行預(yù)培養(yǎng)，2周后取出預(yù)培養(yǎng)的滿江紅-魚腥藻共生體系，切取其分枝頂端約5 mm左右的片段，并確保每一片段帶有2~3個莖尖和15片左右的幼葉;然后將這些片段放置在小紗布袋中用自來水沖洗30~40 min，之后用0.1%的氯化汞溶液浸泡3~4 min進行消毒，取出后迅速用無菌水沖洗十余次，徹底洗去殘留的氯化汞;將消毒后的萍體片段用滅菌的干燥濾紙吸去水分，然后在無菌操作臺中，體式顯微鏡下用解剖針取其莖尖(約0.5 mm，保留幾個葉原基和幼葉)，接種于裝有改良的Hoagland培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于25 ℃光照下培養(yǎng)，經(jīng)過25 d左右可以長成一叢叢萍體.
將分離后長成的萍體分別放在無氮源和有氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在有氮源的培養(yǎng)基中萍體長勢良好，而在無氮源的培養(yǎng)基中不能存活的萍體便是分離成功的，即不含魚腥藻的無藻滿江紅，下文將滿江紅和魚腥藻的共生體系稱為有藻滿江紅(Azollawith Anabaena).
應(yīng)用顯微操作技術(shù)從無菌有藻滿江紅植株葉片的葉腔中取出魚腥藻(Anabaena)，將它接種于無氮培養(yǎng)基，得以成活，即成功獲得了自生的無菌滿江紅魚腥藻，下文將從滿江紅中分離的無菌滿江紅魚腥藻稱為魚腥藻.
改進的Hoagland’s 營養(yǎng)液配方如下：①大量元素：Ca(NO3)2·4H2O 945 mg·L-1，KNO3 506 mg·L-1，NH4NO3 80 mg·L-1，MgSO4·7H2O 493 mg·L-1;②鐵鹽溶液：2.5 mL·L-1(2.78 g FeSO4·7H2O，EDTA 3.73 g，H2O 500 mL，pH=5.5);③微量元素液：5 mL(KI 0.83 mg·L-1，H3BO3 6.2 mg·L-1，MnSO4 22.3 mg·L-1，ZnSO4 8.6 mg·L-1，Na2MoO4 0.25 mg·L-1，CuSO4 0.025 mg·L-1，CoCl2 0.025 mg·L-1，pH=6.0).
2.2 水培試驗方法
水培實驗在3 L的燒杯中進行，分為A、B和C 3組：根據(jù)我國南方某鈾尾礦庫及周邊地區(qū)地表水中鈾的濃度，初始鈾濃度設(shè)定為2.5、5.0 mg·L-1的實驗組和0 mg·L-1的對照組;同時，A、B和C每個濃度設(shè)定3個平行組，溶液體積為1 L.A組中投放7 g無藻滿江紅，B組中投放7 g有藻滿江紅，C組中投放0.2 g魚腥藻(從7 g有藻滿江紅可分離出0.2 g魚腥藻).整個培養(yǎng)過程全部在人工氣候箱中進行，白天溫度設(shè)定為25 ℃，夜晚設(shè)定為22 ℃，光暗周期為14 h/10 h，空氣濕度保持在80%左右.每3 d測定一次水中鈾的濃度并計算水中鈾的去除率，待富集達到平衡后，取出所有的萍體，用濾紙吸干水分稱其鮮重，計算植株的平均生長抑制率及對鈾的生物富集量.
2.3 樣品處理方法
水樣用離心機，以3000 r·min-1的轉(zhuǎn)速沉淀水中的懸浮物，取其上清液直接進行鈾濃度的測量.
植物樣品中鈾的檢測步驟參照文獻(胡南等，2012)：①先用自來水沖洗附著在植株體上的水培液，然后用去離子水洗凈，在室溫下風(fēng)干;②風(fēng)干后的樣品放入80 ℃的烘烤箱中烘烤72 h后，轉(zhuǎn)移至馬弗爐中，在600 ℃下灰化8 h;③準確稱取0.2 g灰分，放入聚四氟乙烯管中進行消解，最后將消解溶液定容至50 mL，待測.植物體內(nèi)鈾含量(mg·kg-1)以灰分計算.
紅外分析樣品制備參照文獻(He et al.，2015)：采用溴化鉀壓片法，首先將富集后的無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻烘干，磨成粉末狀樣品，然后每次取試樣2~3 mg與0.2~0.3 g干燥的KBr粉末在瑪瑙研缽中混勻，充分研細至顆粒直徑小于2 μm，用不銹鋼鏟取70~90 mg放入壓片模具內(nèi)，在壓片機上用5×107~10×107 Pa壓力壓成透明薄片，即可用于測定.
2.4 樣品檢測方法
水樣和植物樣品中鈾含量的檢測按照標準方法(EJ 267.4-1984)進行，采用三正辛基氧膦萃取分離、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-乙氨基苯酚分光光度法測定樣品的鈾含量，檢出限為0.02mg·L-1.
2.5 生物富集量與富集系數(shù)
生物富集量(BW)是單位質(zhì)量的植株在一定的鈾濃度溶液中，所富集鈾的質(zhì)量，它反映的是單位質(zhì)量的植物所能富集的最大鈾的質(zhì)量.生物富集系數(shù)(BCF)反映的是植物對一定鈾濃度的溶液中鈾的富集能力，其計算公式如下：
式中，BCF為生物富集系數(shù)，BW為生物富集量(mg·kg-1)，C為水中鈾的濃度(mg·L-1).
2.6 生長抑制率
生長抑制率(G)是指與對照組相比，鈾脅迫組中植株生長所受到的抑制程度，其計算公式如下：
式中，m0為對照組植株的質(zhì)量(g)，m1為鈾脅迫組植株的質(zhì)量(g).
2.7 統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，p<0.05表示差異顯著，試驗結(jié)果以平均值±標準誤差表示.
3 結(jié)果與討論(Results and discussion) 3.1 水中鈾的去除效率
在無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻作用下，水中鈾濃度的變化如圖 1所示.由圖 1可知，初始濃度為2.5和5.0 mg·L-1的鈾溶液分別經(jīng)過27和36 d的生物富集后，水中鈾濃度達到平衡，其中，在無藻滿江紅的作用下，鈾溶液最終分別降至為0.38和0.84 mg·L-1，鈾的去除率分別為84.8%和83.2%;而在有藻滿江紅的作用下，鈾溶液最終分別降至為0.044和0.046 mg·L-1，鈾的去除率分別為98.2%和99.1%;在魚腥藻作用下，鈾溶液最終分別降至為1.685和3.988 mg·L-1，鈾的去除率分別為32.6%和20.24%.在整個富集試驗過程中，有藻滿江紅對水中鈾的富集及鈾的去除率始終大于無藻滿江紅和魚腥藻，而且在有藻滿江紅的富集作用下，水中鈾濃度降低到了GB 23727-2009規(guī)定的0.05 mg·L-1排放標準以下，單獨采用無藻滿江紅和魚腥藻無法將水中的鈾濃度降至排放標準以下.由此可知，魚腥藻和滿江紅形成的共生體系對水中鈾的去除效果高于單一的魚腥藻和單一的滿江紅對水中鈾的去除效果，滿江紅和魚腥藻在水中鈾的去除過程中發(fā)揮了協(xié)同的作用.Entry等(1999)在利用木薯粉草修復(fù)Sr和Cs 污染土壤時，發(fā)現(xiàn)在土壤中投加灌木真菌可以提高植物的生物量和植物體內(nèi)Sr、Cs 的含量.Chen等(2006)通過盆栽試驗研究了不同種類的菌根真菌對砷超積累植物蜈蚣草吸收復(fù)合污染土壤中鈾和砷的影響，發(fā)現(xiàn)接種菌根真菌處理顯著提高了蜈蚣草根系鈾含量.由此可見，無論是在水介質(zhì)中，還是在土介質(zhì)中，構(gòu)建植物-微生物共生體系對污染環(huán)境進行修復(fù)，其效率要高于采用單一的微生物或植物進行修復(fù).
圖 1 在無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻作用下水中鈾濃度的變化(a.2.5 mg·L-1，b.5.0 mg·L-1)
3.2 生物富集量與富集系數(shù)
在初始濃度為2.5和5.0 mg·L-1的鈾溶液中，無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻對鈾的生物富集量和生物富集系數(shù)如表 1所示.由表 1可知，無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻對鈾的生物富集量隨著水體中鈾濃度的增大而增大，富集系數(shù)隨著水體中鈾濃度的增大而減小，且在同樣的初始鈾濃度下，生物富集量和生物富集系數(shù)均為魚腥藻>有藻滿江紅>無藻滿江紅.當(dāng)水體中的鈾濃度分別為2.5和5.0 mg·L-1時，魚腥藻對鈾的生物富集量和富集系數(shù)都是最大的，生物富集量分別是2686和4250 mg·kg-1，生物富集系數(shù)分別是1074和850.由此可知，魚腥藻提高了有藻滿江紅對鈾的生物富集量和生物富集系數(shù)，從而促進了有藻滿江紅對鈾的富集，提高了有藻滿江紅對水中鈾的去除效率.徐俊等(2009)研究了小白菜和菠菜對鈾的富集量，發(fā)現(xiàn)在100 mg·kg-1的鈾土壤溶液中，菠菜根部的鈾含量達到了433 mg·kg-1(以干重計)，生物富集系數(shù)為2.32.Srivastava等(2010)研究了水生雜草黑藻在鈾濃度分別為20和100 mg·L-1的溶液中的生長狀況及對溶液中鈾的富集情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液中鈾濃度為100 mg·L-1時，該藻類對鈾的富集量最大，為78 mg·kg-1(以干重計)，富集系數(shù)為0.78.Soudek等(2011)研究了20種植物對鈾濃度為0.1~1 mmol·L-1的培養(yǎng)液中鈾的富集情況，發(fā)現(xiàn)玉米對鈾的富集能力最高，其富集量達到160 mg·kg-1(以干重計).本試驗報道的滿江紅和魚腥藻組成的共生體系—有藻滿江紅對鈾的富集量和富集系數(shù)均遠高于上述報道，由此可見，與單一的植物相比，無藻滿江紅和魚腥藻形成的共生體系能更加高效地富集水體中的鈾.
表 1 無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻對水中鈾的富集量及富集系數(shù)
3.3 生長抑制率
在初始濃度為2.5和5.0 mg·L-1的鈾脅迫下，無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻的生長抑制率如圖 2所示.從圖 2中可以看出，在鈾的脅迫下，無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻的生長都受到了不同程度的抑制，且鈾的濃度越高植株生長受到的抑制越明顯，但在相同濃度的鈾脅迫下，生長抑制率表現(xiàn)為無藻滿江紅>有藻滿江紅>魚腥藻.由此可知，魚腥藻提高了有藻滿江紅對鈾的耐受性，從而增加了有藻滿江紅的生物量，促進了有藻滿江紅對鈾的富集，提高了有藻滿江紅對水中鈾的去除效率.分析其原因可能是因為有藻滿江紅體內(nèi)的微生物魚腥藻，在富集鈾的過程中產(chǎn)生了特異性的酶或植物激素，增強了共生體系—有藻滿江紅抗脅迫能力( Glicke et al，2003;韋革宏等，2010;Pan et al.，2015);另一方面的原因是魚腥藻本身具有固氮能力，能為滿江紅提供氮源，促進無藻滿江紅的生長.
圖 2 無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻在鈾脅迫下的生長抑制率(*p<0.05，**p<0.01)
3.4 紅外光譜分析
無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻富集鈾前后的紅外光譜分析如圖 3所示.由圖 3a可知，與富集鈾前相比，在富集鈾后，無藻滿江紅在3420 cm-1處吸收峰移動到3325 cm-1處，峰型發(fā)生明顯變化，說明—OH或—NH2發(fā)生了變化;1641 cm-1處吸收峰移動到1612 cm-1處，說明—CHO基團發(fā)生了變化，1161 cm-1處吸收峰消失，說明多糖分子的C—O鍵發(fā)生了變化.由圖 3b可知，與富集鈾前相比，在富集鈾后，有藻滿江紅在3306 cm-1處吸收峰移動到3428 cm-1處，峰型發(fā)生明顯變化，說明—OH或—NH2發(fā)生了變化;1632處吸收峰型發(fā)生變化，說明多糖分子的主要官能團—CHO發(fā)生了變化;1516 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，分析為芳環(huán)CC骨架振動產(chǎn)生的吸收峰，說明出現(xiàn)了芳環(huán)類的物質(zhì);1447 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，分析為醇類或苷類化合物中C—H彎曲振動產(chǎn)生的吸收峰，說明出現(xiàn)了醇類或苷類化合物;1117 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，1030 cm-1處吸收峰消失，說明多糖分子的C—O鍵發(fā)生了變化.由圖 3c可知，與富集鈾前相比，在富集鈾后，魚腥藻在3445 cm-1處吸收峰移動到3426 cm-1處，峰型發(fā)生明顯變化，說明—OH或—NH2發(fā)生了變化;1738 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，分析為羧酸CO鍵伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰，說明產(chǎn)生了羧酸CO鍵;1632 cm-1處吸收峰型移動到1641 cm-1處，說明多糖分子的主要官能團—CHO發(fā)生了變化;1447 cm-1處新出現(xiàn)的吸收峰，分析為醇類或苷類化合物中C—H彎曲振動產(chǎn)生的吸收峰，說明產(chǎn)生了芳環(huán)和醇類或苷類化合物;1244 cm-1處吸收峰移動到1256 cm-1處，說明醇類、羧酸類化合物中C—O發(fā)生了變化;1146 cm-1處吸收峰移動到1157 cm-1處，說明C—N發(fā)生了變化;1026 cm-1處吸收峰移動到1015 cm-1處，說明多糖分子的C—O鍵發(fā)生了變化.
圖 3 無藻滿江紅(a)、有藻滿江紅(b)和魚腥藻(c)富集鈾前后的紅外光譜圖
無藻滿江紅、有藻滿江紅和魚腥藻富集鈾后的紅外光譜對比分析如圖 4所示.由圖 4可知，相對于無藻滿江紅，有藻滿江紅中和魚腥藻中，151 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，分析為芳環(huán)CC骨架振動產(chǎn)生的吸收峰，說明有藻滿江紅和魚腥藻富集鈾后，產(chǎn)生了芳環(huán)類的物質(zhì);1447 cm-1處新出現(xiàn)的吸收峰，分析為醇類或苷類化合物中C—H彎曲振動產(chǎn)生的吸收峰，說明有藻滿江紅和魚腥藻富集鈾后，產(chǎn)生了醇類或苷類化合物.因此，有藻滿江紅體內(nèi)出現(xiàn)了新的芳環(huán)和醇類或苷類化合物可能是由魚腥藻產(chǎn)生的.而這些新的化合物可能是微生物魚腥藻在富集鈾的過程中分泌的一些胞外物質(zhì)(Homer et al.，1991)，它們可選擇性地與鈾結(jié)合(Kajiawara et al.，2004)，并降低鈾對植物的危害，增加生物量，從而促進有藻滿江紅對鈾的富集.本文的結(jié)果表明，有藻滿江紅富集鈾的過程中，魚腥藻也參與其中，并協(xié)同無藻滿江紅一起富集水中的鈾.但有關(guān)滿江紅和魚腥藻組成的共生體系高效除去鈾的深層機制仍有待進一步的研究.
圖 4 無藻滿江紅(a)、有藻滿江紅(b)和魚腥藻(c)富集鈾后的紅外光譜圖
4 結(jié)論(Conclusions)
1) 有藻滿江紅對水中鈾的去除效率高于單一植物無藻滿江紅和單一微生物魚腥藻，初始濃度分別為2.5和5.0 mg·L-1的鈾溶液，在共生體系有藻滿江紅的作用下，分別經(jīng)過27和36 d生物富集后濃度能降低至GB 23727-2009規(guī)定的0.05 mg·L-1排放標準以下. 具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
2) 魚腥藻提高了有藻滿江紅對鈾的富集量、富集系數(shù)及抗鈾脅迫的能力，從而促進了有藻滿江紅對鈾的富集.
3) 與無藻滿江紅相比，有藻滿江紅體內(nèi)產(chǎn)生了芳環(huán)和醇類或苷類化合物，而這些物質(zhì)是魚腥藻在富集鈾的過程中產(chǎn)生的，它們可能促進了有藻滿江紅對鈾的富集.
