1 引言(Introduction)
TCP是有機廢水中一種最常見的氯酚類物質，主要來源于造紙、印染、紡織等行業廢水.由于TCP的水溶解性較大，且土壤等固體物質對其吸附和固定作用較弱，常以水為載體廣泛存在. TCP結構較為穩定，難以降解，且具有三致性，美國環�？偩忠褜⑵淞袨榱恕皟炏任廴疚铩�. 利用真菌、青霉菌、曲霉菌和酵母菌等生物法處理酚類廢水，工藝簡單，效果好. Lentinula對橄欖油排放廢水中酚類(苯酚等)有毒物質具有較好的去除效果.曲霉菌可以p-甲酚和4-甲基苯酚作為唯一碳源，但對氯酚類效果不大.Kiyohara等發現釀造酵母、鞘脂菌可降解TCP.Aguayo等發現鉤蟲貪銅菌、鞘氨醇單胞菌、光合細菌等也能降解TCP.這些研究為酚類物質的生物處理打下了一定基礎，但國內外大多數研究主要局限于細菌對TCP降解. 相比細菌，真菌具有較強的抗毒性和環境適應能力，在處理氯酚廢水方面較細菌更具優勢. 鐮刀菌為一種真菌，廣泛存在于自然環境中，適應性強. 鐮刀菌具有良好的降解苯酚、4-CP的能力，但對毒性更強TCP的降解情況還未知. 本文研究了鐮刀菌降解TCP的降解影響因素及其效果，并探討了其降解動力學與降解機制.
2 材料與方法(Materials and methods) 2.1 菌種與培養基
菌種：從膨潤土中分離得到的一種鐮刀菌，確定為層出鐮刀菌Fusarium proliferatum，屬于鐮刀菌屬.培養溫度30 ℃.
固體培養基：KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂15~20 g，蒸餾水500 mL. 滅菌后加入相應濃度的TCP搖勻，在無菌操作臺上倒平板，待平板冷卻凝固后進行接種，最后于30 ℃恒溫生化培養箱中倒置培養.
液體培養基：CaCl2 0.1 g，KH2PO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，H2O 1000 mL，微量元素(FeSO4·7H2O 3.82 g，CoCl2·6H2O 0.25 g，H3BO3 6 mg，CuSO4·5H2O 2.9 mg等)1 mL. 所有培養基均在121 ℃下滅菌30 min.
孢子懸濁液：在馴化好且長有豐富的白色分生孢子的蛋白胨瓊脂培養基中刮取部分孢子置于無機鹽固體培養基(含100 mg·L-1 TCP)上，30 ℃恒溫培養. 7 d后轉接于150 mg·L-1 TCP的無機鹽固體培養基馴化3次，待菌體大量長出后于無菌條件下刮取孢子至無菌蒸餾水中，振蕩分散成乳白色的孢子懸液，光密度約為0.1(OD400)，孢子個數為3.1×106 個·mL-1.
2.2 試劑與儀器
試劑：氨水，乙醇(純度>90%)，濃鹽酸，稀鹽酸，三氯酚(TCP)(化學純)，4-氨基安替比林，鐵氰化鉀，NaCl，緩沖溶液.
主要儀器：Agilent1200系列液相色譜儀(安捷掄)，電子天平(METTLER TOLEDO);UV2450PC紫外可見分光光度計(島津);DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海榮豐);LRH-250Ⅱ微電腦控制生化培養箱(廣東醫療);THZ-C恒溫振蕩器(培英);SW-CJ-1F單人水平垂直兩用凈化工作臺(蘇州凈化);MLS-3750高壓蒸汽滅菌器(三洋);CF-RXⅡ高速冷凍離心機(日立).
2.3 TCP的降解條件
取0.05 g過濾出的菌體(濕重)的菌體孢子懸濁液(600 nm處吸光度為0.16～0.165)，加入50 mL液體培養基濃度一定的TCP溶液中，在一定溫度、pH、150 r·min-1下繼續培養，每間隔24 h測定TCP濃度，分別研究溫度、pH、外加碳源、氮源、氯離子及TCP初始濃度對其降解效率的影響. 溫度影響實驗條件為pH 7.0，TCP初始濃度為30 mg·L-1，溫度25 ℃、30 ℃和35 ℃. pH影響實驗條件為30 ℃，TCP初始濃度為30 mg·L-1，pH為2.0~8.0. 外加碳源影響實驗條件為30 ℃、pH 7.0，TCP初始濃度為30 mg·L-1，葡萄糖(1 g·L-1、3 g·L-1、5 g·L-1). 氮源影響實驗條件為30 ℃、pH 7.0，TCP初始濃度為30 mg·L-1，氮源物質為NH4Cl、NaNO2、蛋白胨、NH4NO3和NaNO3(濃度均為0.2 g·L-1). 氯離子影響實驗條件為30 ℃、pH 7.0，TCP初始濃度為30 mg·L-1，NaCl濃度為0~0.6 g·L-1. TCP濃度影響實驗條件為30 ℃、pH 7.0，TCP初始濃度為10~50 mg·L-1. 平行試驗3次，取其平均值.
2.4 動力學分析
根據微生物對底物降解速率與底物濃度的關系，可將這種反應分為不同的級數方程. 當底物降解速率不受反應物濃度影響時，為零級方程. 在溫度不變的情況下，零級方程的降解速率是常數. 本文擬用零級降解動力學方程對實驗數據進行擬合.
2.5 降解產物分析
取不同的降解時間的5 mL培養液于5000 r·min-1，4 ℃離心10 min后，取上清液作為測定樣，以酸化樣為空白對照，堿化樣做測定樣，于190~600 nm范圍內進行紫外掃描，以分析上清液溶質組分差異.
取不同的降解時間的10 mL培養液于10000 r·min-1，4 ℃離心10 min，過濾上層清液. 再用等體積的乙酸乙酯萃取其中的有機物質，氮吹濃縮至1 mL，直接進GC-MS分析，氦氣流速為0.8 mL·min-1. 柱溫為50 ℃，保留5 min，再以20 ℃·min-1程序升溫至280 ℃，保留10 min. 進樣口和檢測器溫度分別為250 ℃和300 ℃.
2.6 分析方法
采用高效液相色譜法(HPLC)對TCP濃度進行測定. 分析儀器為Agilent1200液相色譜儀，色譜柱為Diamonsil C18(2)150 mm×4.6 mm×5 μm，20 μL進樣器，流動相為1%冰乙酸水溶液:1%冰乙酸乙腈溶液=7∶3(體積比)，流速為1 mL·min-1，檢測波長為280 nm. TCP降解率的計算：
式中，C0、Ct分別為降解初始、時間t時TCP的濃度(mg·L-1).
3 結果與討論(Results and discussion) 3.1 溫度對TCP降解的影響
圖 1是不同溫度條件下鐮刀菌對TCP的降解效果. 由圖 1可知，在25~35 ℃條件下，鐮刀菌均能以TCP為唯一碳源和能源物質進行生長. 在30 ℃時，TCP完全降解僅需3 d;而25 ℃和35 ℃時，TCP完全降解則需4 d. 這與鐮刀菌體內TCP相關降解酶活性有關，可能是30 ℃時TCP降解酶活性最強所致.
圖 1 溫度對TCP 降解的影響
3.2 pH對TCP降解的影響
圖 2為不同pH條件下鐮刀菌對TCP的降解影響. 由圖 2可知：pH=7時鐮刀菌對TCP的降解速率最快，3 d降解完成;而pH=6時鐮刀菌對TCP的降解速率稍慢，但TCP完全降解也只需3 d. 當pH=8時鐮刀菌對TCP降解受到了一定的抑制，4 d時TCP降解率為97%. 此外，當pH=2或pH=4時，鐮刀菌對TCP幾乎沒有降解能力. 因此，可認為鐮刀菌在中性或者弱酸弱堿環境中利用TCP進行生長，最適pH=6~7.
圖 2 pH 對TCP 降解的影響
3.3 外加碳源對TCP降解的影響
圖 3是添加不同濃度的外加碳源葡萄糖鐮刀菌對TCP降解影響. 由圖 3可知，鐮刀菌可利用TCP為唯一碳源和能源物質進行生長繁殖，30 mg·L-1的TCP只需3 d即可完全降解，但觀察到鐮刀菌的生長受到了嚴重的抑制. 這是由于葡萄糖與TCP為共基質時，鐮刀菌首先利用葡萄糖，在代謝產生了一些酸性中間產物(實測pH由6降到了2.3)，使培養液呈強酸環境，抑制了鐮刀菌的生長，這與劉艷霞等研究結果一致(劉艷霞等，2012).
圖 3 外加碳源葡萄糖對TCP 降解的影響
3.4 氮源對TCP降解的影響
圖 4為不同氮源對鐮刀菌降解TCP的影響. 由圖 4可知，氮源為蛋白胨時，TCP降解速率最快，完全降解僅需3 d;氮源為NaNO3時，TCP的降解速率次之，但TCP完全降解也僅需3 d. 當氮源物質為NaNO2時，鐮刀菌對TCP的降解受到了明顯的抑制，此時鐮刀菌菌體不能生長. 因此，考慮到實用經濟性，鐮刀菌降解TCP最適氮源為NaNO3.
圖 4 氮源對TCP 降解的影響
3.5 氯離子對TCP降解的影響
圖 5為氯離子濃度對TCP降解的影響. 由圖 5可知，低濃度Cl-(0.2 g·L-1)對鐮刀菌降解TCP具有一定的促進作用，但隨著Cl-濃度的增加，TCP的降解受到了抑制，且Cl-濃度越高，其抑制作用越強. 這說明Cl-是鐮刀菌生長所必須的，但Cl-濃度過高時則會對TCP脫氯過程產生抑制，從而減緩了鐮刀菌對TCP的降解速率. 這與Kargi等研究結果相一致，認為多氯酚物質在微生物體內的代謝主要是一個脫氯的過程，氯離子的存在會對鐮刀菌降解TCP的脫氯過程產生影響(Kargi and Eker，2004，2005;Jesús et al.，2009).
圖 5 氯離子濃度對TCP 降解的影響
3.6 濃度對TCP降解的影響
濃度對鐮刀菌降解TCP的影響如圖 6所示，當TCP濃度在10~50 mg·L-1范圍內時，鐮刀菌均可將其完全降解. 鐮刀菌對TCP的降解速率則隨著TCP濃度的增加而逐漸減緩. 當TCP濃度為10 mg·L-1時，鐮刀菌對其完全降解最快只需2 d即可完成;但當TCP濃度提高到50 mg·L-1時，鐮刀菌對其完全降解則需4.5 d才能完成.
圖 6 鐮刀菌對TCP 的降解零級動力學擬合曲線
3.7 降解動力學
圖 6為不同濃度條件下鐮刀菌降解TCP的動力學擬合曲線. 由圖 6可知，在不同濃度條件下，TCP濃度均隨著降解時間的增加而不斷降低，濃度與降解時間呈較好的線性關系，R2維持在0.87~0.95范圍內(表 1)，說明鐮刀菌對TCP的降解符合零級降解動力學方程.
表 1 鐮刀菌對TCP 的降解零級動力學參數
3.8 降解產物與途徑分析
圖 7是鐮刀菌以TCP為唯一碳源和能源物質時的降解產物紫外掃描圖. 在圖 7中，TCP的特征吸收波長為325 nm，隨著時間推移，其特征峰逐漸消失. 當降解4 d時，其特征峰則完全消失，沒有新的峰產生，這說明TCP已被完全降解.
圖 7 鐮刀菌降解TCP 的產物紫外掃描曲線
圖 8為鐮刀菌對TCP降解2 d的氣相色譜圖，圖 9為TCP降解產物的質量色譜圖. 由圖 8與圖 9知，TCP的保留時間為12.521 min，特征離子m/z為196. 此外，在10.355 min時也出現了一個較為明顯的峰(圖 8)，特征離子m/z為162，經NIST檢索為2，6-二氯苯酚，根據相關資料可推斷其可能為TCP降解中間產物(Spain et al.，1989;全向春等，2003).
圖 8 鐮刀菌降解TCP 中間產物的GC 圖譜
圖 9 TCP 降解產物的質量色譜圖
文獻(Li et al.，l1991)認為，Azotobacter sp.等對TCP代謝降解途徑主要是偏苯三酚途徑，是在2，4，6-TCP-4-單加氧酶(同時存在FADH2和NADH)的作用下依次將對位和鄰位上的氯原子脫去并氧化，形成2，6-二氯對苯二酚，再進一步代謝為6-氯偏苯三酚，進一步脫氯后形成偏苯三酚，然后在偏苯三酚1，2-雙加氧酶的作用下鄰位開環形成馬來酰乙酸，最后進入三羧酸循環進行完全礦化. 在厭氧條件下微生物對TCP的降解途徑是通過直接鄰位/對位脫氯生成2，4-二氯苯酚/2，6-二氯苯酚，再分別通過鄰位或對位脫氯生成苯酚，最后被礦化(Kennes et al.，l1996; Nicholson et al.，l1992 ).根據實驗結果，可推測得出鐮刀菌對TCP的降解途徑如圖 10所示. 它是通過2，6-二氯苯酚途徑進行降解的，這是一個直接脫氯的過程. TCP首先經過對位脫氯形成2，6-二氯苯酚，2，6-二氯苯酚再通過鄰位脫氯形成2-氯苯酚，最后2-氯苯酚鄰位脫氯形成苯酚，隨后進入三羧酸循環，完全礦化.
圖 10 鐮刀菌對TCP 的降解途徑
4 結論(Conclusions)
1) 鐮刀菌降解TCP的最適條件為：氮源NaNO3(0.2 g·L-1)，30 ℃，pH=6~7. 外加碳源葡萄糖對降解TCP具有明顯的抑制作用. 氯離子濃度低于0.2 g·L-1時對鐮刀菌降解TCP具有一定的促進作用，但隨著氯離子濃度的增加，TCP的降解受到了抑制. 鐮刀菌對TCP降解速率隨著其濃度的升高而減緩.
2) 鐮刀菌能降解10~50 mg·L-1的TCP，對其降解反應符合零級降解動力學方程.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。
3) 當以TCP為唯一碳源和能源物質時，TCP特征峰均隨著降解時間的延長而逐漸消失，且無新峰產生. 鐮刀菌降解TCP過程中可檢測到2，6-二氯苯酚(RT 12.521 min)的存在，可認為是通過2，6-二氯苯酚途徑進行反應降解.
