近年來，隨著國家及地方城市污水處理廠對氮、磷排放標準的不斷提高，新一輪提升改造也正同步開展。移動床生物膜反應器（MBBR）因無需增加額外占地和改變原有工藝路線便能實現深度脫氮除磷而受到廣泛關注。另外，該工藝可大幅減少改造工程量，具有運行費用低、管理簡便、處理效果穩定等特點，可較好地解決市政污水處理廠提升改造中的難題。
MBBR具備深度脫氮除磷功能與其兼具活性污泥和生物膜兩種微生物存在形式有著密切關系。為此，國內外很多學者對MBBR中的微生物結構及功能展開了研究。張晶晶等對比分析了MBBR填料生物膜與活性污泥的微生物群落，結果表明好氧和缺氧區填料生物膜的微生物豐度均比活性污泥高，其中好氧區富集了較多的硝化菌，而缺氧區生物膜上的微生物主要以反硝化菌為主；吳迪等分析了山西某污水廠MBBR提標改造前后的菌種變化，結果表明懸浮填料對硝化菌群富集具有重要作用，填料對硝化的貢獻率高達79%，懸浮載體上存在的反硝化菌群為同步硝化反硝化提供了微觀保障，加入懸浮填料后優化了系統的菌落分布，增加了菌群的多樣性；盧欣欣等采用MBBR實現了一體式短程硝化-厭氧氨氧化的耦合，得出MBBR中活性污泥主要完成亞硝化、生物膜主要完成厭氧氨氧化的結論。但是，目前大多數研究僅分析填料生物膜的整體微生物結構，對生物膜不同厚度的生物群落研究較少，無法深入分析污染物去除機理。
鑒于此，筆者對某污水處理廠經MBBR改造后的填料生物膜進行更細微的分類，將填料上的微生物分成表面松散型和內部緊密型生物膜，并對比緊密型生物膜、松散型生物膜和活性污泥的菌群結構與物種特性，進一步探索不同功能菌群的分布及功能，以期為MBBR技術的廣泛應用提供微觀理論支撐。
1、材料與方法
1.1 改造方案
該污水廠處理規模為4×104m3/d，改造前生化段主體工藝為SBR的變形工藝——MSBR（改良式序列間歇反應器），出水水質執行《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB18918—2002）一級B要求。為進一步提高出水水質，達到地表準Ⅳ類水質要求，提出以下改造方案：向MSBR池的主曝氣區投加一定數量的懸浮填料，以提高反應器中的微生物種類和優勢種群數量，從而提高反應器的處理效率。即由MSBR改造為MBBR，于2017年改造完成。
1.2 懸浮填料特性
懸浮填料為思普潤公司生產的SPR-2型懸浮填料，其材質為高密度聚乙烯（HDPE），標稱直徑為（25±0.5）mm；標稱高度為（10±1）mm；密度約為0.94~0.97g/cm³，有效比表面積≥620m2/m3，填料壽命>15年，抗壓強度>50N/mm2，紫外損失值<0.06%。懸浮填料為流化填料，正常運行時懸浮于水中，能使微生物膜有效附著生長以確保運行效果，且其化學性質穩定，長時間浸泡于水中不會分解，亦不會對微生物產生毒害作用，另外，其無需任何支架或其他的固定方式，可自由地分布在池體內。SPR型懸浮填料采用蜂窩狀內部結構、圓筒狀外形等獨特的設計，在保證高空隙率的情況下提高填料比表面積，增加了反應器的生物量，同時可有效改善污水在填料間的流動流態，增強水流紊流程度，減少污水通過填料的阻力。填料的材質和結構使得其具備以下特點：水力特性好，效率高，占地小；能耗低；易于安裝和維護，設計靈活；無生物膜堵塞，易于流化；使用壽命長。改造前經試驗驗證，投加填料10d后，生物膜鏡檢可發現多種微生物，填料掛膜、生物膜馴化成功。
1.3 微生物分析
1.3.1 樣品獲取及處理
2021年9月，于某污水廠生化池內取懸浮填料（運行近4年）及活性污泥用于微生物檢測，活性污泥即反應池內的懸浮污泥。取樣時水溫為30.0℃、pH為7.09。為區分緊密型生物膜和松散型生物膜，進行以下預處理：將取出的懸浮填料立刻置于1000mL燒杯，倒入純水浸沒填料，手動振蕩淘洗5min后取出填料，燒杯內的污泥即為松散型生物膜；經淘洗后，將填料撈出沖洗，仍存留在填料上的生物附著較為緊密，用牙簽和小刀將附著在填料上的污泥刮出，刮出的污泥即為緊密型生物膜。
將收集到的活性污泥、緊密型生物膜和松散型生物膜樣品置于離心機中以5000r/min的速度離心5min，去除上清液后加入去離子水再次離心，重復兩次，保留底部污泥樣品；再用冷凍干燥機對離心后的樣品冷凍干燥。
1.3.2 DNA的提取及PCR擴增
采用E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit（M5635-02，OMEGA，USA）提取污泥樣本的基因組DNA。并對細菌16SrDNA的V4和V5區進行PCR擴增，引物為515F（GTGYCAGCMGCCGCGG TAA）和806R（GGACTACNVGGGTWTCTAAT）。PCR擴增在由15μL的2×PhusionMasterMix、1.5μL引物（2μmol/L）、10μL模板DNA（1ng/μL）以及2μL的超純水混合而成的30μL混合液中進行。將混合液置于95℃下擴增3min，而后繼續95℃下擴增30s（擴增25個循環），然后在55℃下擴增30s，以及72℃下擴增45s，最后72℃下再擴增5min。
1.3.3 測序及數據分析
從2%的瓊脂糖凝膠中用GeneJETGel試劑盒（ThermoScientific）提取出擴增子，并用Nano Drop2000熒光光譜儀（ThermoScientific）進行量化。隨后，每個樣品中提純出的擴增子，在IlluminaMiSeq平臺上按標準方法配對并測序。數據分析采用IlluminaMiSeqPE300平臺，在免費在線I-Sanger平臺上進行分析。
1.4 分析測試方法
COD、NH3-N、TN、TP等采用標準分析方法測定；利用體式顯微鏡觀察填料上的微生物特性。
2、結果與討論
2.1改造前后污染物去除效果對比
MBBR改造前后的進出水水質變化如圖1所示。可以看出，改造前后進水COD濃度波動較大，但出水濃度始終維持在20mg/L以內，表明MSBR和MBBR對COD均有較好的去除效果。另外，改造前后出水NH3-N濃度均維持在0.3mg/L左右，無明顯變化。但值得注意的是，MBBR對TN和TP的去除有明顯的強化作用，其中TN平均去除率從改造前的43.0%提高至改造后的60.3%，出水TP也由改造前的0.35mg/L降至改造后的0.13mg/L，去除率由77.7%提高至91.2%。由此可知，經MBBR改造后，對COD和NH3-N的去除沒有較大影響，但對TN和TP的去除有明顯的強化作用，去除率分別提高了17.3%和13.5%，這可能與投加懸浮填料形成的泥膜混合系統有關，生物膜與活性污泥不同的污泥停留時間使得世代周期較長的反硝化菌能在生物膜上得到有效富集，強化對TN的去除；而世代周期較短的聚磷菌富集于活性污泥中，通過排放剩余污泥達到去除TP的效果。另外，投加填料后的出水水質較為穩定，這表明改造后工藝的抗沖擊能力得到了增強。
2.2 微生物種群分析
懸浮填料的加入一定程度上強化了生化段的處理效能，這與其附著的微生物分布及種類密切相關。對此，本研究根據微生物的分布情況進行取樣：①填料外微生物，即活性污泥；②填料表層生物膜，即松散型生物膜；③填料內層生物膜，即緊密型生物膜。而后，對以上3個樣品進行了高通量測序分析。污泥樣品的多樣性指數見表1。
由表1可知，緊密型生物膜、松散型生物膜和活性污泥樣品的有效序列數分別為43854、41531和36986，覆蓋率均超過99%，即表明所收集到的基因序列能夠很好地代表微生物群落。微生物多樣性用Shannon和Simpson指數表征，Shannon指數越大、Simpson指數越小，則說明物種越豐富。從表1可以看出，相比活性污泥，填料上的緊密型和松散型生物膜物種豐度更低。此外，基于OTUs水平的維恩圖顯示（見圖2），3種類型污泥樣品共有的OTUs為1016個，具有較高的相似度。但與此同時，緊密型和松散型生物膜相比活性污泥獨有的OTUs數量相對較多，表明填料上的微生物群落更具有特異性，這可能是因為填料結構使得緊密型和松散型生物膜富集了特定功能的菌種。
從微生物在門水平上的分析結果（如圖3所示）來看，3個樣品中豐度最高的門為Proteobacteria、Chloroflexi和Actinobacteriota，而這三者也是城市污水處理過程中最常出現的微生物門類。相比之下，Nitrospirota和Dadabacteria的豐度出現了較大差異。Nitrospirota在緊密型生物膜中的豐度為10.5%，而在松散型生物膜和活性污泥中的豐度僅為2.7%和1.3%。此外，Dadabacteria同樣在緊密型生物膜中富集，豐度達到了2.4%，而在松散型生物膜和活性污泥中的豐度僅為0.9%和0.1%。不同的是，Patescibacteria在活性污泥和松散型生物膜中的豐度（3.6%和2.9%）高于緊密型生物膜中的豐度（1.1%）。
從微生物在屬水平上的分析結果（見圖4）來看，活性污泥、松散型生物膜和緊密型生物膜的優勢菌屬存在明顯差異。其中，活性污泥富集了大量硝化菌和除磷菌，包括966-1（3.56%）、norank_f__Saprospiraceae（1.1%）和norank_f__NS9_marine_group（1.34%）等硝化菌，這與活性污泥具有更高的氧含量有關；另外，除磷菌也在活性污泥中實現富集，如norank_f__norank_o__Saccharimonadales（1.76%）可以產磷酸酶，有利于磷酸的礦化，norank_f__Gemmatimonadaceae（1.52%）可以增強磷的轉運，這可能是因為活性污泥相比生物膜具有較短的污泥停留時間，因此更能夠實現除磷菌的富集。
值得注意的是，松散型生物膜上存在著豐度較高的與抗生素耐性基因、耐金屬、有毒污染物和木質素降解等相關的功能菌屬。例如，norank_f__JG30-KF-CM45具有降解抗生素耐性基因及反硝化作用，在松散型生物膜上的豐度達到5.26%，魏健等采用臭氧催化氧化-曝氣生物濾池（BAF）組合工藝對抗生素廢水二級生化處理出水進行深度處理，證明了norank_f__JG30-KF-CM45是降解抗生素類污染物的主要菌屬。另外，與金屬耐受性相關的菌屬在松散型生物膜上也實現了有效富集，包括norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96（4.28%）和norank_f__norank_o__Microtrichales（2.19%）等，Zou等的研究中，norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96屬的相對豐度與Cu、Ni和Se含量呈正相關，表明這些金屬可能對該屬的生長繁殖有促進作用；Girardot等人報道norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96屬在金屬污染的荒地中占據主導地位；Zeng等人在位于化學工業區的含有重金屬的廢水處理廠微生物群落的特征研究中證明了norank_f__norank_o__Microtrichales具有耐Mn、Ni、Cd和Zn的潛力；除此以外，norank_f__67-14（2.54%）對有毒污染物降解活性很強，norank_f__norank_o__SBR1031（1.24%）可降解芳香化合物，unclassified_f__Solirubrobacteraceae（2.39%）具有木質素降解能力。這些菌種在松散型生物膜中大量富集，說明松散型生物膜對有毒有害物質、金屬和抗生素有很好的降解或吸附能力，對緊密型生物膜起到保護作用。絲狀菌Candidatus_Alysiosphaera（1.13%）在松散型生物膜中也被富集，絲狀菌可以起到骨架作用，使生物膜結構更加穩定。耐抗生素、抗金屬、降解有毒污染物等微生物的功能在之前的研究中都已得到證明，在本次研究的污水廠中，進水含有大量工業廢水，與之前研究的條件相一致，進一步證明了松散型生物膜在污水處理過程中具有耐抗生素、抗金屬等特殊作用。
緊密型生物膜上主要富集有反硝化菌、纖維素水解菌和厭氧氨氧化菌等，除此之外，還存在一部分硝化菌。norank_f__Caldilineaceae（8.43%）可以在厭氧條件下促進木質纖維素和半纖維素的分解，其富集可能與該污水處理廠的進水含有造紙廢水有關，此外，該菌屬具有反硝化作用。同樣具有反硝化作用的還有norank_f__norank_o__Dadabacteriales（2.39%）、norank_f__Blastocatellaceae（1.25%）和unclassified_f__Hyphomicrobiaceae（1.67%），這些菌屬均被報道與反硝化有關，說明反硝化作用主要發生在生物膜內部緊密層，這些都與填料生物膜形成的分層結構和生物膜較長的污泥停留時間有關。厭氧氨氧化菌norank_f__Microtrichaceae（2.21%）也在緊密型生物膜中得到富集，該菌屬可利用NO2--N來氧化NH3-N，從而減少碳源的消耗。有趣的是，Nitrospira在緊密型生物膜中的豐度為10.47%，這可能是因為Nitrospira作為硝化菌，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，在氨氮濃度較低環境中更具競爭優勢。此外，檢測到的Pedomicrobium（3.32%）和Hyphomicrobium（2.35%）都屬于鐵、錳氧化微生物，Hyphomicrobium還被報道是一種兼性自養反硝化菌。另外，產EPS的SWB02（1.35%）也在緊密型生物膜中富集，對生物膜的形成和穩定起到了重要作用。
活性污泥、松散型生物膜和緊密型生物膜的優勢菌種及功能總結如表2所示。
泥膜系統菌屬之間可能的協作如圖5所示。總體而言，填料的加入不僅為微生物的生長提供了一個良好載體，同時也改變了MBBR泥膜系統的菌落分布，活性污泥及填料上不同厚度生物膜的優勢菌屬存在明顯區別。生物膜緊密層主要是降解纖維素和反硝化，此外還有厭氧氨氧化和硝化作用發生；松散層起到抗金屬和耐抗生素以及難降解污染物的降解作用，另外起到保護緊密層的作用；活性污泥主要起硝化和除磷的作用。本研究表明，生物膜需要一定的厚度，厚度越厚越有利于對氮和磷的去除，其抗沖擊能力也更強，松散型生物膜也更能起到抗擊毒害和保護緊密型生物膜的作用。
3、結論
①在30℃水溫下，活性污泥、松散型生物膜和緊密型生物膜的優勢菌屬存在明顯區別。活性污泥富集了大量硝化菌和除磷菌；松散型生物膜上存在著豐度較高的與耐抗生素、耐金屬和降解有毒污染物等相關的功能菌屬；緊密型生物膜上主要富集兼具反硝化和纖維素水解的菌屬，以及厭氧氨氧化菌等。但對于低溫下泥膜系統內不同厚度生物膜與活性污泥的微生物群落有待進一步研究。
②活性污泥的氧含量較高且泥齡較短，有利于硝化菌和除磷菌的富集，主要承擔硝化和除磷的作用；松散型生物膜位于填料外層，起到攔截過濾污染物、保護內層生物膜的作用；緊密型生物膜的泥齡較長，有利于反硝化菌的生長，主要進行反硝化反應和纖維素水解。泥膜系統內不同厚度的生物膜與活性污泥之間相互協作，實現了對氮和磷的強化去除。（來源：浙江工業大學環境學院，浙江富春紫光環保股份有限公司）
