再生水回用是解決現代城市缺水問題的有效途徑之一。城市污水處理廠的二級出水中仍含有一定濃度的氮和磷，若直接用作城市景觀水體補水極易引發水體富營養化。若再生水用于補充地下水，則可能造成地下水硝酸鹽污染。過量的硝酸鹽進入人體會導致輸氧的血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，喪失攜氧能力，嚴重甚至會導致窒息。傳統二級處理出水C/N極低，需要投加外部碳源以實現進一步脫氮，此過程不僅導致處理成本增加，同時還存在碳源過量的二次污染風險。
硫自養反硝化生物濾池因為成本低，且反應過程中無需投加碳源等優點而被廣泛關注，其脫氮原理主要是生物膜上的微生物在缺氧環境下以還原態硫為電子供體對硝酸鹽進行反硝化，因此濾池正常運行的前提是濾料表面生物膜的培養和形成。目前，反硝化脫硫菌（NR-SOB）的應用研究主要集中于脫氮硫桿菌，但該菌生長緩慢，且對溫度、鹽度的耐受性不強，實際應用潛力有限�？梢�，合適的掛膜啟動方式對于硫自養反硝化技術的工程應用具有重要意義。
當前硫自養反硝化的脫氮負荷較低，一般在0.12~0.60kg/（m³·d）左右。此外，硫自養反硝化微生物易受到進水水質等環境因素影響，造成出水水質波動。硫源對于反硝化脫氮效果也有較大影響，升華硫和硫代硫酸鈉為硫源的脫氮效果優于生物硫。但受制于成本及危險化學品規定限制，純硫磺濾料無法在工程中直接應用。所以筆者采用新開發的含硫復合填料進行實驗。
目前，針對硫自養反硝化生物濾池合適的掛膜啟動方式還未見詳細研究報道。以北京某再生水廠二沉池出水作為實驗進水，對比了變濾速接種掛膜、固定濾速自然掛膜和變濾速自然掛膜三種啟動方式對硫自養反硝化生物濾池脫氮效果穩定性的影響，同時考察了反應過程中DO、pH和SO42-等參數的變化情況，從而確定適宜的掛膜方法。結合高通量測序技術和硝酸鹽氮的去除機制，探討不同掛膜條件下硫自養反硝化系統中的微生物群落結構，以期為復合硫填料反硝化應用于工程的掛膜啟動提供參考。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置
反應器由4組相同的濾柱組成（如圖1所示），濾柱直徑為150mm、總高為1000mm，其中，底部承托層為150mm高的礫石（直徑為30～50mm），濾料層高為350mm。濾料采用含硫復合濾料。濾料堆積密度為0.8～1.1g/cm3，粒徑為5～15mm，比表面積為30.1m2/g，填充體積為6180cm3。濾池采用上向流設計，二沉池出水通過蠕動泵從底部進水口進入，經過生物濾池填料凈化后從上部的出水口排出。
1.2 接種污泥和原水水質
接種污泥取自北京某再生水廠A2/O工藝的二沉池回流污泥，懸浮固體（MLSS）濃度為8000mg/L。所用原水為二沉池出水，NO3--N、NO2--N、SO42-、DO分別為8.92~16.27、0~0.5、68.62~136.51、1.91~7.97mg/L，濁度為0.56~2.21NTU，pH為6.74~8.07。
1.3 實驗方法
反應器的啟動分為三種方式：固定濾速自然掛膜、變濾速自然掛膜和變濾速接種掛膜，氮去除量達到10mg/L時調整空床停留時間（EBCT），由120min逐漸縮短至20min，1#、2#、3#不接種污泥，4#接種1L二沉池回流污泥。其中，1#、2#采用固定濾速自然掛膜，EBCT分別為30、20min，相應的進水氮負荷為0.58、0.86kg/（m³·d）；3#采用變濾速自然掛膜，EBCT依次為120、60、45、40、30min，對應的進水氮負荷為0.14、0.29、0.38、0.43、0.58kg/（m³·d）；4#采用變濾速接種掛膜，EBCT依次為120、60、45、40、30、20min，對應的進水氮負荷為0.14、0.29、0.38、0.43、0.58、0.86kg/（m³·d）。
1.4 分析方法
水樣經0.22μm濾膜過濾后進行水質分析，NO3--N、NO2--N、SO42-：賽默飛ICS-1100離子色譜，溫度、pH、DO：WTW/Multi3420測定儀。1.5高通量測序分析取北京市某再生水廠二沉池回流污泥和穩定運行階段的掛膜濾料（變濾速接種掛膜和變濾速自然掛膜）送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序分析。濾料取自濾料層的中部，對樣品16SrRNA的V3-V4區進行擴增，所用引物為338F與806R。
2、結果與討論
2.1 固定濾速自然掛膜
分別以EBCT為30、20min啟動反應器，分析運行25d的NO3--N去除情況和NO2--N的生成情況，結果見圖2。兩種情況下的平均脫氮負荷分別為0.37、0.35kg/（m³·d），平均氮去除率分別僅為65.59%和41.48%，無法達到相關研究0.75kg/（m³·d）的脫氮負荷。在EBCT=30min的情況運行到第8～15天時，平均氮去除量為10.1mg/L，說明反硝化菌在掛膜初期也有脫氮效果。在EBCT=20min下運行，系統僅在第8天和15天出現氮去除量大于10mg/L的現象。兩種情況下都存在出水水質不穩定和亞硝酸鹽積累的現象，說明在自然掛膜初期反硝化菌的脫氮性能極易受到環境因素影響，需要合適的恒化培養環境。
2.2 變濾速自然掛膜
2.2.1 變濾速自然掛膜啟動分析
在整個變濾速自然掛膜階段，在1～16、17～22、23～51、52～65、66～104和105～120d，調整EBCT分別為120、60、45、40、30、20min（即第一～六階段），運行結果見圖3。在每個時間段，出水NO3--N濃度先升高后降低，出水NO2--N濃度在調整初期會出現部分積累，最大積累量為5.92mg/L。
在第一階段，出水NO3--N從12.70mg/L逐漸降低至2.12mg/L，但是在第7天升至7.63mg/L，說明在掛膜初期脫氮效果不穩定，易受環境影響。第二階段的氮去除量有所增加，可穩定在10mg/L以上且無NO2--N積累，平均氮去除率為95.22%，表明硫桿菌等脫氮菌的生物量比上一階段有所增加，氮去除量主要受制于底物濃度。
在第三和第四階段，氮去除量隨進水水質波動，掛膜培養時間分別需要29d和14d，EBCT為40min情況下的微生物培養時間短于EBCT為45min的，分析原因可能是EBCT降低，單位時間進水硝酸鹽量增加。
在第五階段，調整流速初期出現NO2--N積累，7d后達到最大值5.92mg/L，隨后逐漸降低，24d后完全消失。運行25d后，氮去除量連續3d可達10mg/L以上，隨后有所降低。
在第六階段，進水水質波動較小，進水NO3--N最大變化量為3.8mg/L，進水NO2--N均小于0.01mg/L，平均氮去除量為10.21mg/L，氮去除率達到90%以上，其間達到最大脫氮負荷即0.81kg/（m³·d）。
2.2.2 不同EBCT的脫氮效果比較
根據掛膜后穩定運行7d的進出水水質數據，計算不同空床停留時間下的平均氮去除量和脫氮負荷，結果見圖4。
在EBCT為120、60、45、30、20min的條件下，對應的平均氮去除量分別為11.27、10.97、8.69、9.63、9.76mg/L，在空床停留時間縮短并培養穩定后，氮去除量的變化不明顯。在EBCT=45min時，脫氮負荷增加量不大，這可能是由于實驗期間水溫變化使氮去除量降低導致的。各空床停留時間下的脫氮負荷分別為0.14、0.26、0.28、0.46、0.71kg/（m³·d），脫氮負荷隨空床停留時間縮短、流速增大而逐漸增加。
2.3 變濾速下兩種掛膜方式的脫氮效果比較
在變濾速接種掛膜的情況下（見圖5），分別在第9、26和66天調整空床停留時間，最終在EBCT=30min時平均氮去除量為7.88mg/L，最大脫氮負荷為0.52kg/（m³·d），平均氮去除率為66.86%。
對比接種掛膜（見圖5）和自然掛膜（見圖3）的脫氮效果，接種掛膜在初期可以較早地達到10mg/L的氮去除量，比自然掛膜早9d，說明污泥中存在好氧菌，能更快地消耗進水溶解氧，為上層濾料微生物提供缺氧條件。后續調整EBCT的時間接近，表明是否接種污泥對后期生物膜的生長速率沒有影響。在EBCT為30min的運行工況下，接種掛膜的氮去除量低于自然掛膜，且在進水水質相對穩定的條件下，脫氮效果也不如自然掛膜穩定。
對比不同空床停留時間下亞硝酸鹽積累情況，改變空床停留時間后接種掛膜和自然掛膜均會出現亞硝酸鹽積累的現象，說明在提高進水負荷以后微生物的生長隨著底物濃度的增加產生變化。硝酸鹽還原酶Nar的合成速率可能高于亞硝酸鹽還原酶Nir，導致Nar對電子的競爭能力高于Nir，在有限的空床停留時間內亞硝酸鹽還原不徹底，故出現出水亞硝酸鹽積累。隨著微生物和酶逐漸培養成熟，完成亞硝酸鹽還原過程，亞硝酸鹽含量逐漸降低。在EBCT為45min時，兩種掛膜方式的亞硝酸鹽消失時間相同，亞硝酸鹽積累量小于1mg/L所需的時間均為10d；在EBCT為30min時，自然掛膜的亞硝酸鹽消失時間比接種掛膜晚3d。
劉玲花等接種純脫氮硫桿菌株去除地下水中的硝酸鹽，發現當濾料中同時存在脫氮硫桿菌和異養反硝化菌時，接種純脫氮硫桿菌株意義不大，控制合適的pH、溫度和停留時間即可，本實驗結果進一步證明了此結論。
2.4 運行參數對脫氮效果的影響
2.4.1 DO對脫氮效率的影響
DO對反硝化有很大影響，主要是由于DO和NOx--N競爭電子供體。在氧分壓較低的情況下，反硝化作用為微生物的生長提供替代產能途徑；氧分壓過高會抑制硝酸鹽還原酶的合成及活性。相關研究認為脫氮硫桿菌是一類兼性厭氧菌，在好氧條件下其優先利用氧為電子受體，反硝化過程受到抑制；在缺氧或厭氧條件下，脫氮硫桿菌利用硝酸鹽作為電子受體，完成生物反硝化過程。
自然掛膜反應器出水口的平均DO為0.19mg/L（見圖6），僅在啟動初期出現較高的DO，掛膜階段的進水DO平均為5.25mg/L，掛膜初期的氮去除量較低，出水DO剩余3.24mg/L，說明部分硫桿菌在好氧情況下利用氧為電子受體抑制了反硝化過程。在掛膜后期，雖然進水DO均大于6mg/L，但依然具有明顯的脫氮效果，表明反應器下層填料生物膜中存在好氧菌，先消耗了進水中的DO，為上層的生物膜創造了缺氧環境。
2.4.2 pH變化
考察了變濾速自然掛膜運行周期內NO3--N去除量與pH變化量的關系，結果見圖7。pH變化量隨NO3--N去除量的增大而增加。pH會改變底物和菌體酶蛋白的帶電狀態，從而影響細菌對營養物質的吸收以及代謝過程中酶的活性。合適的進水pH可保證生物自養反硝化所需要的還原性環境，根據其反應方程式，自養反硝化1mgNO3--N需要消耗4.57mg堿度（以CaCO3計）。
pH變化量不能完全反映堿度變化，但有學者發現當pH為6.5~8.0時，NO3--N去除速率均在3.1mg/（L·h）以上，硫桿菌能取得較為滿意的反硝化效果。本實驗進水pH范圍為6.74~8.07，平均NO3--N去除速率為28.92mg/（L·h），表明該再生水廠二沉池出水滿足自養反硝化過程中的堿度消耗，無需控制進水pH。
2.4.3 氮去除量對硫酸鹽濃度的影響
硫自養反硝化過程中硫單質提供電子供體被氧化成SO42-，由于市政污水排放標準對硫酸鹽濃度沒有具體要求，《生活飲用水衛生標準》（GB5749—2022）要求SO42-不超過250mg/L，該裝置出水SO42-最大值為224.78mg/L，平均值為157.3mg/L，克服了一般硫自養反硝化出水SO42-過高的問題。圖8（a）反映了掛膜過程中去除單位無機氮產生SO42-量（SO42-/ΔTIN）的變化情況。參照硫自養反硝化反應方程式，SO42-/ΔTIN的理論值為7.54，實際平均值為9.42，說明反應器中主要進行的是硫自養反硝化過程。
由圖8（b）可知，掛膜過程中去除單位TIN產生的SO42-量并非完全與理論值相同，在第17～23、38～44、78～83、88～94、100~105天出現實際值低于理論值的現象，推測可能的原因有：反應器中存在異養反硝化；硫氧化不完全生成了副產物，比如SO32-、S2O32-等；硫酸鹽還原菌（SRB）利用水中的有機物將SO42-還原為S2-。在運行過程中也出現了高于理論值的現象，其主要出現在啟動初期和調整濾速后，分析原因可能為：進行不完全的反硝化，TIN去除量沒有增加，但該過程中消耗電子供體；一些好氧菌利用水中微量溶解氧將硫單質氧化為SO42-。
2.5 微生物群落結構解析
2.5.1 變濾速接種和自然掛膜的微生物群落
變濾速接種掛膜和自然掛膜兩種方式培養的生物膜中，在門水平上占比較多的為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycete），豐度分別為58.12%、9.98%、15.49%、3.41%和71.66%、14.64%、5.44%、2.51%，與前人研究的硫自養反硝化系統微生物群落一致。
變形菌門中大部分微生物可以利用氫、氨、甲烷和揮發性脂肪酸等進行反硝化作用。綠彎菌門的某些菌屬被發現有異養特性，可利用系統中溶解性微生物產物作為碳源將NO3--N轉化為NO2--N，反映了NO3--N在反應器中的去除過程。擬桿菌門的部分微生物具有降解高分子化合物（纖維素、蛋白質和脂類等）為簡單有機物并還原NO3--N的能力，說明反應器中可能存在異養反硝化菌利用污泥中的內碳源進行協同反硝化，一定程度上解釋了SO42-的產生量低于理論值的現象。此外，酸桿菌門（Acidobacteriota）也被證明有脫氮基因（兩種方式下的豐度分別為2.24%和1.06%），具有相應的反硝化能力。
另外，在屬水平上，Dokdonella、Thiobacillus、Comamonadaceae、Terrimonas、SBR1031、Thermmonas、Ferritrophicum、Ferruginibacter、Xanthomonadaceae、A4b、others（豐度<1.0%都歸為others）的相對豐度分別為21.13%、10.94%、2.45%、2.82%、5.41%、2.66%、2.67%、1.26%、2.62%、2.57%、48.04%和31.49%、6.38%、6.82%、4.04%、1.43%、3.86%、3.66%、3.82%、2.48%、1.52%、34.49%。硫桿菌屬（Thiobacillus）是以還原態硫為電子供體還原NO3-、NO2-的專性化能自養菌，其相對豐度較大，說明系統內進行硫自養反硝化過程，和TIN去除量與SO42-產生量關系的分析結果一致。接種掛膜（10.94%）的硫桿菌屬占比高于自然掛膜（6.38%）。
孤島桿菌（Dokdonella）中部分微生物為嚴格異養和好氧菌，有學者曾在需要曝氣的同步硝化反硝化工藝中檢出，孤島桿菌的檢出驗證了濾池底部存在好氧菌消耗進水DO的猜想，自然掛膜中的孤島桿菌豐度高于接種掛膜，說明自然掛膜方式更易去除進水中的溶解氧，為硫桿菌創造缺氧環境，解釋了自然掛膜濾池的脫氮負荷高于接種掛膜的現象。
此外在生物膜中也檢測到了具有硫自養反硝化功能的熱單胞菌屬（Thermomonas）細菌，其在接種掛膜法和自然掛膜法系統中的相對豐度分別為2.66%和3.86%。
2.5.2 二沉池回流污泥的微生物群落
二沉池回流污泥中主要優勢菌屬不動桿菌屬（Acinetobacter）和Tetrasphaera菌屬的相對豐度分別為16.22%和10.46%（見圖9）。Acinetobacter是活性污泥中常見的好氧菌，解釋了接種掛膜初期較早達到10mg/L氮去除量負荷的現象。Tetrasphaera菌屬可以進行反硝化，將硝酸鹽還原至亞硝酸鹽但不能完全反硝化至氮氣。硫桿菌屬和熱單胞菌屬在二沉池回流污泥中含量較低，均未檢出，說明在兩種掛膜方法的反應器中均存在明顯的菌種馴化過程。從另一個角度看，由于都需要重新馴化硫自養反硝化相關菌屬，那么采用二沉池回流污泥的接種掛膜法和自然掛膜法相比，在操作上多了運輸污泥的步驟，故此方法在實際工程中沒有顯著優勢。
3、結論
①固定濾速掛膜會出現亞硝酸鹽積累和脫氮效果不穩定的問題，硫自養反硝化工藝用于實際工程時，在保證出水水質的前提下，建議采用變濾速自然掛膜。
②變濾速自然掛膜的脫氮負荷最高可達0.81kg/（m³·d），高于變濾速接種掛膜的0.52kg/（m³·d）。在改變水力停留時間后接種掛膜和自然掛膜均會出現亞硝酸鹽積累的現象，在穩定運行期間，自然掛膜的脫氮負荷優于接種掛膜。
③針對實際二沉池出水，進水溶解氧過高會抑制脫氮過程，對于pH無需額外控制，SO42-實際產生量略高于理論值。
④反應器中進行硫自養反硝化的細菌在屬水平上主要有Thiobacillus和Thermomonas屬，相對豐度分別為6.38%和3.86%，其與二沉池回流污泥相比存在明顯的馴化過程。接種掛膜和自然掛膜過程都需要重新馴化硫自養反硝化相關菌屬，接種掛膜在實際工程應用中沒有顯著優勢。（來源：北京工業大學北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室，北京城市排水集團有限責任公司，北京城市排水集團有限責任公司科技研發中心）
