1 引言(Introduction)

　　苯酚(phenol)作為一種原生質(zhì)毒物，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，長(zhǎng)期飲用被苯酚污染的飲用水或食物，對(duì)人類(lèi)的健康將造成極大的危害，苯酚對(duì)人體皮膚、粘膜有強(qiáng)烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能，吸入高濃度蒸氣可致頭痛、頭暈、乏力、視物模糊、肺水腫等.因此，美國(guó)環(huán)保署把苯酚列入129種優(yōu)先污染物和65種有毒污染物之列，中國(guó)也將苯酚列入環(huán)境優(yōu)先處理的污染物“黑名單” 之中(Basha et al.，2010).

　　國(guó)內(nèi)外苯酚主要的生產(chǎn)方式為氯苯水解法、苯磺酸鈉堿熔法、異丙苯氧化法等，為了提高苯酚產(chǎn)量，常在生產(chǎn)過(guò)程中加入無(wú)機(jī)鹽催化劑，并進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，此過(guò)程會(huì)使得體系中鹽度增大，后期廢水中不僅含有苯酚等有機(jī)污染物，也含有大量的鹽分(Ca2+、Mg2+、Cl-、Na+)使廢水難以處理.目前含酚廢水處理手段主要有兩大類(lèi)，即生物處理法和物理處理法.由于生物處理法具有操作較簡(jiǎn)單、成本低廉、處理效果好、所需要的環(huán)境條件比較溫和、對(duì)環(huán)境造成的二次污染很小等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于苯酚廢水的處理之中.目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者在苯酚廢水處理方面做了大量的研究，并篩選出多種具有良好苯酚降解效果的苯酚降解菌，但是這些菌耐鹽能力弱，當(dāng)酚類(lèi)廢水中鹽度超過(guò)一定濃度，其生長(zhǎng)以及降解苯酚的效果會(huì)受到嚴(yán)重影響.利用耐鹽高效苯酚降解菌株對(duì)苯酚進(jìn)行降解，不僅可以有效的降解廢水中的苯酚，也解決了一般菌株在高鹽條件下難以降解苯酚的難點(diǎn).另外，對(duì)微生物苯酚降解效果產(chǎn)生影響的因素較多，傳統(tǒng)的單因素實(shí)驗(yàn)難以區(qū)分各個(gè)因素之間的主次,所以尋求耐鹽高效苯酚降解菌及其最佳降解條件具有重要意義.

　　本實(shí)驗(yàn)以海利(常德)有限公司污水處理池中提取的水樣為菌源，通過(guò)篩選、分離、馴化得到在高鹽條件下以苯酚為唯一碳源能源的苯酚降解菌，經(jīng)耐鹽和苯酚降解能力測(cè)定，得到耐鹽高效苯酚降解菌zhtI.對(duì)耐鹽高效苯酚降解菌zhtI菌落形態(tài)、菌體特征、生理生化反應(yīng)、16S rRNA序列分析確定菌株的種屬，利用響應(yīng)面法(RSM)進(jìn)行優(yōu)化處理從而提高苯酚降解菌zhtI的降解效率，并對(duì)耐鹽高效苯酚降解菌zhtI進(jìn)行降酚動(dòng)力學(xué)研究，研究結(jié)果將為生物法處理苯酚廢水提供新的技術(shù)思路.

　　2 材料與方法(Materials and methods) 2.1 樣品來(lái)源及耐鹽高效苯酚降解菌的分離與純化

　　以海利(常德)有限公司苯酚廢水處理池所取水樣作為篩選苯酚降解菌株的菌源.通過(guò)逐漸提高苯酚濃度的馴化方法，將水樣樣品按2% 的接種量接種于以100 mg · L-1苯酚為唯一碳源，鹽度2%的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中;溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r· min-1，好氧培養(yǎng)2 d 后，以2%接種量轉(zhuǎn)接至苯酚濃度為200 mg·L-1，鹽度2%的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，直到苯酚濃度達(dá)到1000 mg·L-1;然后進(jìn)行平板涂布，將培養(yǎng)皿放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至苯酚濃度1000 mg·L-1，鹽度2%的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中;經(jīng)反復(fù)平板涂布，最后篩選出具有耐鹽高效苯酚降解能力的菌株，保存在鹽度2%，苯酚濃度為100 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基上.

　　2.2 培養(yǎng)基

　　富集培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：蛋白胨10 g·L-1，酵母膏5 g·L-1，鹽度2%，pH值7.0，121 ℃下滅菌20 min，備用(LB固體培養(yǎng)基需加入18%瓊脂粉).

　　無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)：KH2PO4 1 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，(NH4)2SO4 0.04 g·L-1，MnSO4 .H2O 0.01 g·L-1，NaH2PO4 0.4 g·L-1，MgSO4.7H2O 0.1 g·L-1，F(xiàn)e2(SO4)3.H2O 0.01 g·L-1，NaMo4.2H2O 0.01 g·L-1，加水定容至1000 mL，121 ℃下滅菌20 min，備用.

　　2.3 實(shí)驗(yàn)方法 2.3.1 菌體細(xì)胞濃度測(cè)定

　　用分光光度計(jì)，測(cè)定光密度(OD值)設(shè)定為600 nm，進(jìn)行菌體濃度測(cè)定.

　　2.3.2 苯酚濃度的測(cè)定

　　運(yùn)用4-氨基安替比林法測(cè)定苯酚的含量(潘杰等，2015).

　　2.3.3 形態(tài)特征鑒定

　　用肉眼觀察菌落的形狀、大小、顏色、邊緣特點(diǎn)、透明度、粘稠度、濕潤(rùn)度以及是否隆起.通過(guò)染色劑對(duì)降解菌進(jìn)行染色(革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、莢膜染色等)，在高倍顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并用掃描電鏡觀察菌體表面形態(tài).

　　2.3.4 生理生化特性的測(cè)定

　　按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(Garrity，1974)進(jìn)行甲基紅實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、乳糖氧化發(fā)酵、明膠液化實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、精氨酸雙水解途徑檢測(cè).

　　2.3.5 16S rDNA序列分析

　　擴(kuò)增通用引物： 27F 5′-AGACTTTGATCCTGGCTCAG -3′，1492R 5′-ACGGTT ACCTGTTACGACTT-3′

　　擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)：模板 DNA液10 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 1 μL、Taq 酶 2 μL、兩種引物各1 μL、ddH2O 31 μL.

　　PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃(5 min)預(yù)變性→[95 ℃(30 s)→55 ℃(30 s)→72 ℃(90 s)](35cycles)→72 ℃(10 min)→4 ℃(holding)

　　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳實(shí)驗(yàn)，獲得目的條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行16S rRNA序列分析確定菌株的種屬.

　　2.4 降解條件優(yōu)化

　　實(shí)驗(yàn)選取苯酚濃度、葡萄糖濃度、接種量、溫度、pH值、鹽度等6個(gè)對(duì)菌株zhtI降解苯酚影響最明顯的因素，根據(jù)Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)11個(gè)考察因素進(jìn)行N=12的組合實(shí)驗(yàn)，以苯酚降解率為響應(yīng)值，從中篩選出對(duì)菌株降解苯酚影響最顯著的3個(gè)因素;再通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以Box-Benhnken設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后用Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到最佳降解條件組合.2.5 耐鹽苯酚降解菌的降酚動(dòng)力學(xué)研究

　　本文在降解菌的最佳培養(yǎng)條件下，以苯酚作為唯一碳源和能源，測(cè)定菌株對(duì)NaCl的最大耐受能力，根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)測(cè)得的苯酚濃度和菌體生長(zhǎng)量，求出不同苯酚濃度所對(duì)應(yīng)降解速率，然后求出比降解速率值，最后運(yùn)用origin7.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，得出相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，鑒定菌株是否符合底物抑制模型.

　　3 結(jié)果與討論(Results and discussion) 3.1 菌株的分離及鑒定 3.1.1 菌株的分離

　　通過(guò)逐步提高苯酚濃度，從挑取的97個(gè)單菌落中分離純化得到12株具有耐鹽高效苯酚降解能力的菌株，分別命名為zhtA、zhtB、zhtC、zhtD、zhtE、zhtF、zhtG、zhtH、zhtI、zhtJ、zhtK、zhtL.對(duì)分離純化得到的12株耐鹽高效苯酚降解株進(jìn)行降酚能力的測(cè)定，其中菌株zhtI的降解效果最佳，苯酚的降解率達(dá)到了80%以上.由此可知，在高鹽條件下菌株zhtI對(duì)苯酚的降解能力最強(qiáng).

　　3.1.2 菌株的鑒定

　　對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)特征鑒定，結(jié)果顯示，菌株zhtI菌落呈圓形、白色、邊緣整齊、中間隆起、濕潤(rùn)有光澤、較粘稠、不產(chǎn)色素，呈桿狀，無(wú)端生鞭毛，無(wú)莢膜結(jié)構(gòu)，無(wú)芽孢結(jié)構(gòu).菌株zhtI的革蘭氏染色陽(yáng)性、甲基紅實(shí)驗(yàn)陰性、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性、精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、VP實(shí)驗(yàn)陰性、淀粉水解實(shí)驗(yàn)陰性、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、乳糖氧化發(fā)酵陰性、明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性.根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》初步確定菌株zhtI為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.).

　　圖 1 菌株zhtI的菌落形態(tài)及掃描電鏡

　　菌株zhtI的16S rDNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到一條大小在1400 bp左右的片段.測(cè)序得到菌株zhtI的16S rDNA核苷酸序列全長(zhǎng)為1339 bp.經(jīng)過(guò)BLAST同源性比對(duì)，菌株zhtI與Acinetobacter guillouiae(Genbank登錄號(hào)為：KC904085)的同源性達(dá)到100%，按照16S rDNA序列的同源性在97%即為同一個(gè)種的標(biāo)準(zhǔn),初步鑒定菌株zhtI為一株Acinetobacter guillouiae.菌株zhtI的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖 2所示.

　　圖 2 菌株zhtI的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

　　3.4 菌株降酚效率的影響因素及降酚條件優(yōu)化 3.4.1 培養(yǎng)條件對(duì)降酚效率的影響及分析

　　通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得出，NaCl濃度為3%時(shí)，菌株zhtI對(duì)苯酚的降解率達(dá)到最大值85.4%.在苯酚濃度為800 mg·L-1時(shí)，降解率達(dá)到最大值87.1%;當(dāng)苯酚濃度高于800 mg · L-1時(shí)，菌株zhtI的生長(zhǎng)量及其對(duì)苯酚的降解率均逐步下降;當(dāng)pH值為7.5時(shí)，菌株zhtI對(duì)苯酚的降解率達(dá)到最大值;當(dāng)接種量為6%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量和苯酚降解率最高，而當(dāng)接種量超過(guò)6%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量和苯酚降解率變化均不明顯;當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，菌株zhtI對(duì)苯酚的降解率達(dá)到最大值，當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，菌株zhtI對(duì)苯酚的降解率和生長(zhǎng)量均下降;外加碳源對(duì)菌株zhtI降解苯酚的效率影響較大，初始過(guò)程中菌株降解苯酚受到一定抑制，這是由于外加碳源被優(yōu)先利用，但在后期苯酚的降解率上升明顯，其中添加葡萄糖對(duì)菌株zhtI降解苯酚的促進(jìn)作用最佳，能使苯酚的降解率達(dá)到91.6%;外加硝酸類(lèi)氮源會(huì)使菌株zhtI降解苯酚的效率受到抑制，培養(yǎng)基中存在的NO-3是苯酚降解酶系的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，使酶的活性降低，這與以硝酸鹽作為外加氮源會(huì)影響或抑制菌株對(duì)苯酚的降解研究結(jié)果一致.

　　3.4.2 菌株zhtI降酚條件的優(yōu)化

　　(1) Placket-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　根據(jù)Placket-Burman設(shè)計(jì)原理得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 1所示.

　　　　表 1 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

　　從表 1可知，實(shí)驗(yàn)組5的苯酚降解率最高，達(dá)到93.79%;實(shí)驗(yàn)組12的苯酚降解率最低為40.37%.運(yùn)用SPPS 19.0軟件進(jìn)行擬合，得到方程：Y=69.93-8.71X1+43X2+9.85X3-0.62X4+4.71X5-1.14X6

　　X1表示苯酚濃度(mg · L-1);X2表示葡萄糖濃度(%);X3表示pH值;X4表示接種量(%);X5表示溫度(℃);X6表示鹽度(%).

　　通過(guò)Design Expert軟件分析得到模型P=0.0355，說(shuō)明該模型在研究區(qū)域擬合性良好;一般情況下變化系數(shù)越低說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度越高，本實(shí)驗(yàn)變化系數(shù)為11.78%，表示Placket-Burman實(shí)驗(yàn)可信度和精確度比較高.線(xiàn)性回歸分析結(jié)果如表 2所示.

　　表 2 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

　　從表 2可知苯酚濃度、葡萄糖濃度及pH值對(duì)菌株zhtI降解苯酚的影響比較顯著，其影響大小順序?yàn)楸椒訚舛?P=0.0134)>pH值(P=0.0193)>葡萄糖濃度(P=0.0211)，其它因素對(duì)菌株zhtI降解苯酚的影響P值均大于0.05，所以影響效果不顯著.由此可推斷，酚濃度、葡萄糖濃度及pH為影響菌株zhtI降解苯酚的關(guān)鍵因素.

　　(2) 響應(yīng)面法對(duì)菌株zhtI降酚條件的優(yōu)化

　　由2.5.1 節(jié)篩選出3個(gè)對(duì)菌株zhtI苯酚降解效率產(chǎn)生影響的主要因素，即苯酚濃度、葡萄糖濃度、pH值，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以苯酚降解率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，組合方案見(jiàn)表 3.

        表 3 中心組合實(shí)驗(yàn)方案

 

　　苯酚濃度A、 葡萄糖濃度B、pH值C作如下變換Z1=(A - 800)/10、 Z2=(B-6)/1、Z3=(C-7.5)/10，以A、B和C為自變量，以苯酚降解率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).結(jié)合響應(yīng)面分析三維圖(圖 3)，可更加直觀地看出各個(gè)因素之間的相互作用，以及各個(gè)因素對(duì)苯酚的降解不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，對(duì)響應(yīng)值大小的影響存在一極值點(diǎn).

　　圖 3 影響菌株zhtI降解苯酚的各因素交互作用響應(yīng)曲面

　　采用SAS RSREG程序?qū)�響�?yīng)值與各因素進(jìn)行處理，進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程：

　　Y=93.08+0.91Z1-2.66Z2-0.33Z3-2.72Z1Z2-0.40Z1Z3+1.00Z2Z3-2.90Z21-3.10Z22-10.582Z3，以及回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 5.

　　從表 4方差分析結(jié)果(F值)可得，對(duì)苯酚降解效率產(chǎn)生影響的3個(gè)因數(shù)大小依次為：葡萄糖濃度(Z2)>苯酚濃度(Z1)>pH值(Z3)，其中失擬項(xiàng)數(shù)值大小為0.331 7，大于0.05，表示失擬不顯著，因此該模型穩(wěn)定，可作為各個(gè)因素水平對(duì)苯酚降解率影響的預(yù)測(cè).根據(jù)回歸方程，得到A=801.6，B=5.56，C=7.3，即苯酚濃度為801.6 mg·L-1，葡萄糖濃度為5.56%，pH值為7.3.將Z1、Z2、Z3代入回歸方程可得Y=93.23，即菌株zhtI能使苯酚的降解率達(dá)到93.23%.

　　　表 4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果

　　　

　　(3) 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

　　為了檢驗(yàn)響應(yīng)面分析方法的可靠性，按照優(yōu)化后的條件(苯酚濃度801.6 mg·L-1、葡萄糖濃度5.56%、pH值7.3、接種量6%、溫度30 ℃、鹽度3%)進(jìn)行苯酚降解實(shí)驗(yàn)(3次平行實(shí)驗(yàn))，培養(yǎng)72 h，結(jié)果檢測(cè)到苯酚降解率分別為93.68%、92.47%、93.02%，取平均值為93.06%，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間偏差非常小，具有良好的擬合性，優(yōu)化后菌株zhtI對(duì)苯酚的降解能力得到提升.說(shuō)明響應(yīng)面法能有效的對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化和預(yù)測(cè)，節(jié)約成本.

　　3.5 菌株zhtI的降酚動(dòng)力學(xué)研究 3.5.1 菌株zhtI對(duì)苯酚耐受性檢測(cè)結(jié)果

　　菌株zhtI在pH值7.3、接種量6%、溫度30 ℃、鹽度3%、搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1的不同苯酚濃度MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h.菌株zhtI的最高耐受苯酚濃度為1750 mg·L-1，當(dāng)苯酚濃度過(guò)高時(shí)，菌株zhtI的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制甚至失活.對(duì)菌株zhtI進(jìn)行降酚的動(dòng)力學(xué)研究，降酚解動(dòng)力學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù)如表 5所示.

　　　表 5 菌株zhtI苯酚降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

將表 5中的數(shù)據(jù)與Andrews抑制方程模型進(jìn)行多元線(xiàn)性回歸，如圖 4所示，得到公式中的模型參數(shù)為：μmax=2.142 h-1，KS=126.952 mg·L-1，Ki=476.191 mg·L-1.模型方差為R2=0.9979.可知苯酚降解模型動(dòng)力學(xué)方程曲線(xiàn)與實(shí)驗(yàn)值的擬合良好.對(duì)Andrews抑制方程求導(dǎo)可得�� mg·L-1，此時(shí)μ取最大值為1.054 h-1.

　　圖 4 苯酚降解模型動(dòng)力學(xué)方程擬合曲線(xiàn)與實(shí)驗(yàn)值

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　1) 將篩選出的耐鹽高效苯酚降解菌zhtI進(jìn)行菌落形態(tài)、個(gè)體特征、生理生化鑒定，初步確定菌株zhtI為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.).對(duì)菌株菌株zhtI進(jìn)行16S rDNA基因測(cè)序分析，通過(guò)BLAST與Genbank中相關(guān)序列比對(duì)以及MEGA4.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株zhtI為Acinetobacter guillouiae.

　　2) 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定菌株最適鹽度為3%，最適苯酚濃度為800 mg·L-1，最適pH值為7.5，最適接種量為6%，最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，最適外加碳源為葡萄糖，外加NO-3類(lèi)氮源對(duì)菌株降解苯酚有抑制作用;利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定葡萄糖濃度、苯酚濃度、pH值為菌株降解苯酚的3個(gè)主要因素，采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，確定最優(yōu)降解條件為：苯酚濃度801.6 mg·L-1、葡萄糖濃度5.56%、pH值7.3、接種量6%、溫度30 ℃、鹽度3%，該條件下培養(yǎng)72 h，菌株zhtI對(duì)苯酚的降解率可達(dá)到93.23%具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3) 菌株zhtI以苯酚為唯一碳源，接種于pH值7.3、接種量6%、鹽度3%、溫度30 ℃的液體MS培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1培養(yǎng)72 h，菌株zhtI對(duì)苯酚的最大耐受濃度為1750 mg·L-1.菌株zhtI降解苯酚的動(dòng)力學(xué)模型符合典型的底物抑制模型，動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：μmax=2.142 h-1，KS=126.952 mg·L-1，Ki=476.191 mg·L-1.