1 引言(Introduction)

　　隨著農村畜禽養殖業從個體散養走向集約化養殖, 畜禽養殖產生的廢物已經成為我國農村環境污染的主要來源之一.集約化豬場每百頭豬每天產生的廢水可高達2~3 m3.據國家環保局統計, 2002年我國畜禽糞便產生量達27.5億t, 畜禽糞便每年流失至水體的總氮和總磷分別為87萬t和34.5萬t.規�；�畜禽養殖場產生的污水通常采用沼氣池厭氧發酵處理, 以求資源化利用發酵產生的沼氣.但與此同時產生的大量沼液中仍然含有高濃度的氮、磷等營養鹽.經過沼氣池發酵處理的豬場沼液具有兩大特點：一是氨氮濃度高且是污水中的主要氮源;二是污水中氮、磷濃度差異大.經對豬場沼液的周年監測, 發現原始沼液中總氮濃度可高達800 mg·L-1, 氨氮濃度超過700 mg·L-1, 總磷超過3 mg·L-1.將其直接排放到水體中會導致嚴重的水體富營養化, 破壞水域生態系統平衡.在2014年最新的《中華人民共和國環境保護法》頒發及人們對生態環境質量要求提升的大背景下, 高效的畜禽糞污無害化處理技術對實現畜禽養殖業的可持續發展和生態文明具有重要的意義, 尋找高效的沼液綜合利用技術和沼液無害化處理技術顯得尤為急迫.

　　微藻細胞能以光為能源, 從水體中吸收硝態氮、氨態氮及磷酸鹽等營養物質用于合成細胞, 從而降低水體中的氮磷營養鹽.同時, 生成的微藻細胞又可用于飼料、新能源生產等多種用途.因此, 微藻作為畜禽養殖污水的生物處理及資源化利用的載體近來備受關注.已有研究表明, 利用污水中的氮磷等營養鹽培養微藻, 能有效去除污水中的氮磷營養鹽, 實現環境保護及資源的循環利用.Wang等(2010)將小球藻(Chlorella sp.)接種到厭氧分解后的牛糞污水中, 經21 d可去除76%~83%的總氮和63%~75%的總磷.Zhang等(2008)發現, 固定化柵藻(Scenedesmus sp.)對污水中氮磷的去除率最高達100%.劉林林等(2014)發現, 狹形小樁藻(Characium angustum)SHOU-F87在豬場養殖污水中可以去除64%的總氮和96%的總磷.不同微藻對水體中的氮磷等營養鹽的耐受、吸收和利用能力不同(劉林林等, 2014).當營養鹽水平足以滿足浮游植物生長時, 浮游植物對氮磷的吸收基本按照Redfield比例(N:P=16:1) 進行(Redfield, 1958).而豬場養殖污水經厭氧發酵后形成的沼液中, 氮磷濃度極度不平衡, 尤其是氨態氮濃度高, 而總磷濃度低.極高的氮磷比遠遠偏離藻類生長的正常需求, 不符合微藻的最適生長條件.盡管利用微藻凈化污水的研究已有大量報道, 但在污水中補充限制性磷鹽以提高微藻生長及營養鹽的吸收效率的研究尚少.本試驗所用綠球藻(Chlorococcum sp.)是一株從豬場養殖污水中分離出的藻株, 對污水環境適應性強.穆亮亮等(2016)研究發現, 此株綠球藻具有耐高溫的特性, 在培養溫度為35 ℃時, 藻細胞密度和油脂含量最高, 且可以耐受40 ℃高溫.

　　因此, 本文通過研究該株綠球藻在添加不同濃度磷的污水中生長及凈化污水的特點, 以期尋找到綠球藻在污水中生長較好且去除氮、磷效率較高的最適氮磷比.

　　2 材料和方法(Materials and methods)2.1 試驗材料2.1.1 藻種來源

　　試驗藻株分離自浙江嘉興余新鎮敦好農牧有限公司露天沼液存貯池, 在實驗室進行純化并逐級擴大培養后用于本試驗, 該藻種經顯微鏡鑒定為綠球藻屬(Chlorococcum sp.).

　　2.1.2 試驗污水

　　試驗用沼液取自上海市光明集團明錦畜牧有限公司的養豬場, 沼液經沉淀處理后, 再經500目篩網過濾, 并用自來水稀釋至氨氮濃度約為300 mg·L-1后用于本試驗.

　　2.2 試驗方法

　　在氨氮濃度約為300 mg·L-1的污水中, 添加不同量的NaH2PO4以調節污水N:P配制成可溶性氮、磷物質的量濃度比分別為8:1、16:1、32:1和64:1的系列污水, 以不添加NaH2PO4的原污水作為對照組(N:P比約為532:1).各組水質指標如表 1所示.將預先擴大培養的綠球藻離心收集藻細胞, 然后將收集的藻細胞分別接種到裝有1000 mL不同氮磷比污水的錐形瓶中, 初始接種密度為400×104 cells·mL-1, 每組設置3個平行.將綠球藻置于光照培養箱中進行培養, 溫度35 ℃, 光照3000 lx, 光照周期為24 L:0 D(24 h光照, 0 h黑暗).每天定時搖瓶3次, 隔天用血球計數板計數藻細胞密度, 每隔2 d測定培養水體中氮、磷變化情況.試驗進行12 d, 實驗結束時收集藻細胞測量生物量干重.

　　表 1 試驗用污水的水質指標狀況

　　2.3 指標檢測

　　采用血球計數板測定藻細胞密度, 并采用式(1) 計算相對生長率K(成永旭, 2005).

　　式中, N0為培養初始藻細胞密度(cells·mL-1), Nt為培養t天后的藻細胞密度(cells·mL-1), t為培養時間(d).

　　培養水體經0.45 μm微孔濾膜抽濾后進行檢測, 參照《水和廢水監測分析方法(第4版)》(國家環境保護總局, 2002)測定水樣中氮、磷水平.其中, 氨態氮測定采用納氏試劑分光光度法;硝態氮測定采用紫外分光光度法;總氮測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法;總磷測定采用鉬酸銨分光光度法.

　　氮、磷去除率r的計算見式(2)(劉林林等, 2014).

　　式中, C0和Ct分別為初始氮、磷的濃度和培養t天后的濃度(mg·L-1).

　　培養結束后, 每組取80 mL藻液經預先恒重過的0.45 μm微孔濾膜抽濾, 將濾膜置于鼓風干燥箱中105 ℃烘至恒重, 計算生物量干重B (穆亮亮, 2016)：

　　式中, W0為預恒重過的0.45 μm微孔濾膜的質量(g), W1為恒重過后0.45 μm微孔濾膜+藻泥的總質量(g), V為抽濾的藻液體積(L).

　　2.4 數據處理與分析

　　結果以平均值±標準差表示, 采用PASW Statistics 18.0軟件進行單因素方差分析和Duncan多重比較, 以 p<0.05表示差異顯著.

　　3 結果(Results)3.1 綠球藻在不同氮磷比污水中的生長狀況

　　不同氮磷比污水中綠球藻生長曲線如圖 1所示.由圖可知, 前6 d為指數生長期, 之后各組藻細胞密度趨于平緩后開始下降.在培養8 d后, N:P為8:1、16:1、32:1、64:1處理組和對照組藻的相對生長率分別為0.248、0.256、0.261、0.279和0.244.N:P為64:1組的綠球藻生長最好, 在第8 d時藻細胞密度最高為3646×104 cells·mL-1, 第12 d時細胞密度為3393×104 cells·mL-1, 均顯著高于其他組(p < 0.05);其次為32:1和16:1組, 對照組的細胞密度最低.

　　圖 1綠球藻在不同氮磷比污水中的生長曲線

　　培養12 d后, 不同氮磷比污水中綠球藻的生物量干重如圖 2所示, N:P=64:1組藻生物量(以干重計)最高(0.49 g·L-1), 其次為32:1和16:1組, 均顯著高于對照組(p < 0.05).

　　圖 2綠球藻在不同氮磷比污水中的生物量(不同小寫字母表示不同實驗組之間存在顯著差異(p<0.05))

　　3.2 不同氮磷比對綠球藻去除污水氨態氮的影響

　　培養12 d后, 各處理組的綠球藻對豬場污水的氨態氮去除率均較高, 達70%以上(圖 3).N:P為64:1組對氨態氮的去除率達到最高, 為74.94%, 氨態氮濃度從291.31 mg·L-1降低至73.01 mg·L-1;其次是32:1、16:1和8:1組, 去除率分別為73.71%、73.40%和71.44%, 均顯著高于對照組(p < 0.05).對照組對氨態氮的去除率最低(68.79%), 氨態氮濃度從291.31 mg·L-1降低至90.91 mg·L-1.

　　圖 3不同氮磷比污水對綠球藻去除氨態氮的影響

　　3.3 不同氮磷比對污水中硝態氮濃度的影響

　　培養過程中, 各處理組水體中的硝態氮濃度呈升高趨勢(圖 4).培養12 d后, N:P為64:1組的硝態氮濃度最高, 從13.31 mg·L-1增加至48.66 mg·L-1, 其次是32:1和16:1組, 均顯著高于對照組(p < 0.05).對照組硝態氮增加量最低, 從13.31 mg·L-1增加至38.21 mg·L-1.

　　圖 4不同氮磷比對污水中硝態氮濃度的影響

　　3.4 不同氮磷比污水對綠球藻去除總氮的影響

　　由圖 5可知, 初始水體中總氮濃度為290.84 mg·L-1, 試驗結束時, N:P為64:1組的總氮去除率最高, 水體中總氮濃度降低至148.96 mg·L-1, 總氮去除率為48.8%.其次為32:1和16:1組, 且三者之間無顯著差異(p>0.05), 但均顯著高于對照組(p < 0.05).對照組的總氮去除率最低, 為42.71%, 培養結束時水體中總氮濃度為166.61 mg·L-1.

　　圖 5不同氮磷比污水對綠球藻去除總氮的影響

　　3.5 不同氮磷比污水對綠球藻去除總磷的影響

　　不同處理組水體中總磷濃度的變化如圖 6所示, 各處理組的總磷去除率隨N:P增大而增大.總磷去除率最高的為對照組, 達到82.74%, 其次為64:1組, 去除率為71.86%.試驗結束時, N:P為64:1和對照組污水中總磷濃度分別為3.07和0.22 mg·L-1.N:P為8:1組的總磷去除率最低, 僅為33.62%.

　　圖 6不同氮磷比污水對綠球藻去除總磷的影響

　　4 討論(Discussion)

　　氮是微藻生長過程中一種重要的營養素, 主要用于合成細胞內蛋白質及其他具有生理活性的含氮化合物.微藻可以利用多種形式的氮源, 但微藻生長狀態與氮源的形式和數量有密切聯系.通常情況下綠藻類會優先利用氨態氮, 直到耗盡后才開始利用硝態氮.因此, 選擇綠藻門的微藻可以較好地適應畜禽養殖污水的特點, 利用氨態氮作為其生長的氮源, 從而達到凈化污水的目的.然而, 高濃度的氨氮對微藻生長具有抑制作用, 微藻能夠耐受的氨態氮濃度隨著藻種的不同存在差異.本試驗采用的綠球藻, 正是一株從豬場污水中篩選出的綠藻藻株, 相比天然水體中分離的微藻, 其對高氨氮污水的適應性更強.

　　磷是微藻合成磷脂、核酸、核苷酸等物質的重要元素, 是微藻生長必需的基本營養素.微藻對磷的吸收有2種用途, 一是合成細胞內物質, 如磷脂等;另一種被稱為“奢侈消費”(luxury uptake), 即微藻吸收過量的磷并以無機多磷酸鹽形式貯存，當外界磷濃度受限制時, 藻細胞內貯存的磷酸鹽則可被利用.因此, 當微藻進入在一個相對缺磷的培養體系中, 微藻仍然可以利用先前貯存的磷源實現一定的生長.

　　本研究中, 在初始氨氮濃度為291.31 mg·L-1的條件下, 無論是否添加磷源, 各組污水中的綠球藻都表現出良好的生長性能, 其中, N:P為64:1組在第8 d時具有最大的細胞密度, 從最初的400×104 cells·mL-1上升到3646×104 cells·mL-1, 相對生長率達0.279, 12 d時生物量達0.49 g·L-1.劉林林等(2014)研究了狹形小樁藻在豬場污水中的生長性能, 其最高相對生長率為0.120.嚴佳琪等(2012)研究了5種淡水微藻在f/2培養基條件下的生長性能, 其中, 綠球藻SHOU-F3的最高相對生長率K為0.21.對比上述研究與本試驗結果發現, 本研究所用綠球藻在豬場沼液中的相對生長率較高, 表明此株綠球藻在高氨氮濃度污水中生長較好, 且污水的N:P比值對耐污綠球藻的生長產生了顯著影響.培養液中N:P影響微藻生長已在多種微藻中得到證實.劉皓等(2010)用不同氮磷比培養液培養中肋骨條藻(Skeletonema costatum)和威氏海鏈藻(Thalassiosira weissflogii), 結果發現, N:P為64:1組的生長率和細胞數量最高.Rhee(1978)發現, 柵藻(Scenedesmus sp.)在不受任何營養物質限制的情況下, 所需N:P為30:1.Li等(2010)報道了柵藻(Scenedesmus sp.)的最適氮磷比是5:1~8:1.Kim等(2013)認為微藻生長最適的氮磷比取決于氮源種類.盡管Stumn提出藻類的“經驗分子式”為C106H181O45N16P, 但藻細胞組成會受藻種不同及培養條件等因素影響, 不同藻種代謝途徑有差異, 因此, 16:1并不是所有藻株最適的氮磷比(Arbib et al., 2013).本研究中, 綠球藻在污水中生長的最適氮磷比為64:1, 也遠遠大于Redfield比值(N:P=16:1).這可能與該藻株分離自豬場污水有關.豬場污水中氮相對于磷顯著偏高, 推測該株綠球藻已經適應了在高氨氮濃度及高氮磷比條件并生長存活.這也進一步暗示通過適當的誘導馴化, 可以提升微藻適應高氨氮濃度及高氮磷比的能力.

　　培養液氮磷比值不但影響綠球藻的生長, 還影響綠球藻對污水中氮、磷的吸收凈化效果.本研究發現, N:P約為532:1的原污水中綠球藻生長和去除氮效果最差, 添加NaH2PO4調整N:P后, 各組綠球藻的生長和去除氮效果均有改善.綠球藻在N:P為64:1的污水中生長最好, 且對氨態氮、總氮去除率高達74.94%和48.78%, 氨氮的濃度降至73.01 mg·L-1, 基本達到集約化畜禽養殖業水污染物最高允許日均排放濃度限定的70 mg·L-1 (浙江省環境保護局等, 2005).說明在豬場養殖污水中磷不足條件下, 綠球藻對氮的吸收受到限制, 補充磷源后, 綠球藻的細胞密度和對氮的去除效果明顯提高.Martineza等(2014)也發現在培養微藻的無磷培養液中添加磷源后, 藻細胞內磷濃度和培養液中氨態氮的去除率顯著增加.Wang和Lan(2011)發現, 富油新綠藻(Neochloris oleoabundans)對污水中氮的去除受N:P影響顯著, 而磷的去除對N:P不敏感.Beuckels等(2015)的研究結果表明, 氮濃度對磷的去除率有積極影響, 磷的高效去除需要高濃度的氮.這為以后提高豬場養殖污水中氮的去除效率提供了有力依據.

　　對照污水中綠球藻的生長曲線和污水中氨態氮、總氮和硝態氮的去除曲線, 可以發現, 在綠球藻快速生長的前6 d, 污水中的氨態氮也呈快速下降的趨勢, 且各組間的氨態氮去除率隨微藻的相對生長率增大而增大, 表明微藻的快速生長是引起污水中氮、磷濃度下降的主要原因.然而, 在此期間, 硝態氮沒有被利用, 反而濃度略升高.一方面, 可能是豬場養殖污水中存在硝化細菌, 硝化細菌將部分氨態氮轉化成硝態氮所致.另一方面, 也可能是微藻快速生長過程中光合作用產生的氧, 加速了部分氨態氮氧化成硝態氮所致.培養期間, 藻細胞生長的同時, 氨態氮、總氮和總磷濃度下降而硝態氮濃度上升的現象也證明了該株綠球藻優先利用氨態氮的特點.

　　然而, 對照污水中綠球藻的生長曲線和污水中總磷的吸收曲線, 盡管在綠球藻快速生長的前6 d, 污水中的總磷也呈快速下降的趨勢, 但各組總磷的去除率并不與各組綠球藻的相對生長率存在正相關, 初始總磷水平越低, 總磷的去除率越高.N:P為8:1組的初始磷濃度最高(87.62 mg·L-1), 前6 d對磷的去除率為30.08%, 而對照組初始磷濃度最低(1.27 mg·L-1), 前6 d的磷去除率高達82.74%, 但高磷水平組總磷的絕對去除量更高, 此結果也證明了微藻對磷的“奢侈消費”現象.N:P為64:1組在綠球藻培養12 d時的總磷去除率達71.86%, 總磷濃度降低為3.07 mg·L-1, 低于集約化畜禽養殖業水總磷最高允許日均排放濃度限定的7 mg·L-1 (浙江省環境保護局等, 2005).然而, 通過添加磷源以提高微藻對豬場廢水的凈化效率會增加處理成本, 從現實應用的角度, 還需考慮其經濟性能.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

　　5 結論(Conclusions)

　　污水中氮磷比值影響綠球藻生長及其對污水中氮、磷的凈化效果, 在初始氨氮濃度為291.31 mg·L-1的豬場養殖污水中, 通過添加NaH2PO4以調節污水N:P為64:1, 接種綠球藻(Chlorococcum sp.)培養12 d后, 可使污水中的氨態氮和總磷分別降低到73.01 mg·L-1和3.07 mg·L-1, 基本達到相關排放標準.