隨著我國環境問題的日益凸現，工業廢水和生活污水厭氧生物處理技術受到越來越多關注.與好氧生物處理技術相比，厭氧生物處理技術具有占地面積小、污泥產率系數低、運行費用少和可回收能源等優點.隨著第三代高效厭氧反應器的發展，厭氧生物處理技術在廢水處理領域已經得到了廣泛應用，并取得了良好的應用效果.
一般來講，厭氧反應器處理高濃度有機廢水具有天然優勢，較高的污泥濃度可以保證反應器在高容積負荷條件下穩定運行，高濃度有機物為微生物提供了充足的代謝基質，產生的大量甲烷氣體同時有利于促進系統內的傳質作用.但對于處理污染物濃度較低的城市生活污水，厭氧反應器的容積負荷和污泥負荷均明顯降低，在低負荷條件下，厭氧反應器的運行特征和微生物代謝特性均可能發生較大改變，如低基質濃度條件下顆粒污泥由于營養物質的匱乏是否會出現解體和絮狀化，進而反應器對污染物去除效率是否會明顯降低等這些不確定性，意味著實現厭氧反應器高效率處理城市生活污水依然具有較大的挑戰性.
本實驗采用自主研發的強化循環厭氧反應器 (SCAR) 處理模擬城市生活污水，在穩定的上升流速 (Vup) 條件下，研究厭氧生物處理城市生活污水的可行性和反應器的運行特性. SCAR反應器在空間上將反應器分為主體反應區和精細反應區，并通過外循環作用改善反應器的傳質作用.本實驗考察了HRT對反應器處理效能的影響，探討反應器運行過程中顆粒污泥的粒徑分布、SMA和輔酶F420及EPS等污泥性狀的變化特征，并借助高通量測序技術分析反應器不同時空條件下微生物菌群結構分布特點及其演變過程.本實驗結果可為驗證厭氧生物處理城市生活污水的可行性提供依據，有利于拓展厭氧生物處理的應用領域，以期為城市生活污水處理帶來高效、低能耗、低占地面積的新途徑.
1 材料與方法1.1 實驗用水
本實驗使用的模擬城市生活污水，COD濃度在450 mg·L-1左右，氨氮和總氮濃度分別為28 mg·L-1、57 mg·L-1左右，總磷5 mg·L-1左右;配制生活污水的主要成分如下 (mg·L-1)：蔗糖，200;馬鈴薯淀粉，100;奶粉，30;蛋白胨，100;豆油，10;牛肉汁，30;尿素，5;NH4Cl，100;K2HPO4，20;CaCl2，5;FeSO4·7H2O，5.8;MgSO4·7H2O, 6，同時加入適量的微量元素.為了使模擬生活污水具有一定的pH緩沖能力，加入適量的NaHCO3.
1.2 接種污泥
本實驗接種泥取自某造紙廠IC反應器中的厭氧顆粒污泥.污泥的平均粒徑為2.19 mm，MLSS為48.45 g·L-1，MLVSS/MLSS為0.79，沉降性能良好.在反應器啟動前，接入28 L的接種污泥，約占反應器總容積的2/5.
1.3 實驗裝置與運行程序
本實驗裝置如圖 1所示.
圖 1 SCAR處理生活污水流程示意
SCAR由有機玻璃加工而成，直徑0.2 m，高2.0 m，有效容積70 L.反應器自下而上設5個取樣口，各個取樣口距離反應器底端距離分別為25、60、100、140和170 cm，分別命名為A號、B號、C號、D號、E號取樣口.生活污水經計量泵從底部進入反應器，通過反應器主體反應區和精細反應區處理后由出口排出;外循環污水通過恒溫水浴箱加熱，維持反應器內部溫度在30℃±1℃;三相分離器分離排出的氣體經濕式氣體流量計計量后排放.
反應器共運行120 d，由100 d運行階段和20 d恢復階段組成.實驗過程中，關閉反應器的內循環，只通過外循環泵控制系統的循環量，維持污水在反應器中的上升流速 (Vup為空塔速度) 為4 m·h-1的條件下運行，并以縮短HRT的方式逐步提高反應器容積負荷.
1.4 分析項目及方法
COD、MLSS、MLVSS的測定采用標準方法;輔酶F420：紫外分光光度法;產甲烷活性 (SMA) 采用史氏發酵法[12];顆粒污泥粒徑分布采用篩分法;揮發性脂肪酸 (VFAS) 測定采用氣相色譜法測定 (氣相色譜儀：gc7890，15 m×0.53 mm FFAP)，測樣前甲酸酸化 (pH < 2);厭氧顆粒污泥的胞外聚合物 (EPS) 采用熱提法進行提取，多糖含量采用蒽酮-硫酸法測量，蛋白質含量采用BCA法測量.
采用高通量測序技術進行基因組測序.首先采用E. Z. N. ATM Mag-Bind Soil DNA Kit (OMEGA) 提取總DNA.利用Qubit2.0 DNA (Life) 檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應應加入的DNA量.擴增對象為16S rDNA 的V3-V4區.細菌PCR擴增所用的引物為通用引物341F-805R;古菌通過巢式PCR擴增，第一輪擴增所用引物為M-349F，GU1ST-1000R，第二輪PCR所用的引物為通用引物349F-806R. PCR實驗結束后，其產物進行瓊脂糖電泳檢測，然后用磁珠法進行純化回收.最后利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收產物精確定量，按照1:1的等量混合后取樣上機測序，測序由上海生工生物工程公司完成.對測序結果進行分析處理，首先通過Barcode (標簽序列) 區分樣品序列，并對各樣本序列進行質量控制，去除非靶區域的序列及嵌合體.然后基于97%相似度下進行OTU (操作分類單元) 聚類，獲取每一個OTU的代表性序列，通過RDP分析進行物種注釋，計算每個樣本在不同分類等級下的相對豐度.最后繪制物種豐度圖.
2 結果與討論2.1 不同負荷條件下SCAR的處理效能
SCAR中接種厭氧顆粒污泥，在HRT=15 h、反應器容積負荷為0.7 kg·(m3·d)-1條件下啟動反應器.反應器啟動后的前20 d內，反應器對污染物的去除效率隨時間基本呈現高低起伏，但總體上呈逐漸增加趨勢，至20 d時污水COD去除效率基本穩定在75%左右，另外反應器出水中僅含少量VFAs，實現了對SCAR的啟動運行.
通過改變HRT，將SCAR的容積負荷分4個階段逐漸由0.7 kg·(m3·d)-1提升至0.89、1.18、1.77及2.7 kg·(m3·d)-1，對應HRT分別為12、9、6和4 h.由圖 2(a)可見，在HRT分別為12、9和6 h時，每次提高容積負荷后的1~3 d內，由于代謝底物量的增加和負荷改變對微生物空間相對位置的擾動，反應器對污水COD去除效果變差，但隨著反應器的運行，微生物逐漸適應了新的負荷條件，污水COD去除率逐漸回升.而隨著HRT的縮短，減少了代謝底物的生化反應時間，反應器對污水COD的平均去除率會有所降低，但下降幅度較小，反應器對COD平均去除率基本可以維持在75%以上.隨著污水HRT降低至4 h，在此條件下運行的20 d內，反應器出水平均COD由107 mg·L-1提高到209 mg·L-1，COD去除率由75.3%降低到50.8%，而且出水中一直含有大量VFAs，這說明較短的HRT無法滿足厭氧酸化作用生成的有機酸類物質進行充分堿性發酵所需的反應時間.隨后將HRT調至12 h，反應器運行狀況迅速好轉，COD去除率很快回升到75%左右.由此可見，在保證代謝基質充分生物降解時間條件下，SCAR反應器對一定范圍內變化的容積負荷具有良好的適應能力;本實驗條件下，HRT=6 h可以保證SCAR對生活污水具有良好的處理效率.
(a) 進出水COD、COD去除率、進水負荷;(b) 揮發性脂肪酸
圖 2 SCAR在不同HRT條件下的處理效果和運行狀況
在有機物厭氧生物降解過程中，VFAs的產生主要和進水水質、反應器類型以及HRT等有關.由圖 2(b)可見，隨著反應器HRT的減小和容積負荷的提高，反應器出水中的VFAs含量也相應增加，分析其原因有二，其一是代謝底物量的增加，其二是堿性發酵時間的縮短;HRT為15、12、9和6 h時，反應器可以實現對生成有機酸的充分代謝，但HRT為4 h時，VFAs開始出現明顯積累，尤其乙酸含量的增加特別明顯.這表明，較短的HRT可以充分完成對生活污水代謝底物的水解酸化過程，但是實現充分的堿性發酵作用必須要保證一定的代謝反應時間，產甲烷的堿性發酵過程是厭氧反應的限制階段.在圖 2(b)還可以看見，在充足的HRT條件下 (HRT不小于6 h)，反應器出水中均有乙酸或者丁酸出現，而未檢測出丙酸和戊酸.根據甲烷細菌代謝底物類型的不同，可以將產甲烷生化代謝分為還原CO2途徑、乙酸途徑和甲基營養途徑;由此可以推測堿性發酵過程中酸類物質的可能代謝途徑：丙酸通過裂解生成甲基和乙酸，而戊酸裂解生成甲基和丁酸，而生成的甲基和部分乙酸進入乙酸途徑被代謝，從而造成了系統中乙酸和丁酸的少量累積.
2.2 不同負荷條件下SCAR反應器顆粒污泥的特性2.2.1 各階段污泥的粒徑分布和污泥濃度的比較
粒徑分布是反映厭氧顆粒污泥特性的重要參數之一，粒徑大小影響著微生物分布狀況與有機物的傳質效果，也可以反映出污泥的營養狀況[3];SCAR運行期間反應器主體反應區顆粒污泥粒徑 (φ) 分布和污泥濃度隨HRT的變化情況見圖 3.
圖 3 SCAR運行過程中的粒徑分布和污泥濃度的變化情況
在接種的顆粒污泥中，φ>1 mm的顆粒污泥比例占90%，φ>2 mm的顆粒污泥比例占60%;在HRT=12 h運行階段，φ>1 mm的比例降至80%，φ>2 mm的比例下降至47%;HRT=6 h時，φ>1 mm的比例回升至81%，粒徑在1~2 mm間的顆粒污泥已經由接種時的30%提高至44%;HRT=4 h時，φ>1 mm的比例已經提高至86%，其中φ1~2 mm的污泥已經占了52%，而且φ < 1 mm的比例相比前一個周期也降低了5%.整個實驗期間，顆粒污泥粒徑變化的基本趨勢是小顆粒 (φ < 1 mm) 與大顆粒污泥 (φ>2 mm) 逐漸減小，而中間粒徑污泥 (φ在1~2 mm之間) 的量逐漸增多.反應器運行前期接種泥粒徑較大，低濃度的生活污水提供的營養不足，大顆粒污泥因為得不到充分代謝底物容易在內部形成空腔，進而破碎形成較小粒徑污泥;營養物質進入小粒徑顆粒污泥時阻力相對較小，小顆粒污泥容易成長，而更加細小污泥在較高上升流速 (Vup) 條件下也容易被洗出，這些綜合作用造成了中間粒徑顆粒污泥比例的增加.
隨著容積負荷提高，反應器污泥濃度變化和φ>1 mm顆粒污泥變化趨勢一致.在反應器啟動階段，主體反應區接種泥濃度為52.19 g·L-1，在進水負荷較低條件下，微生物負荷較低，內源呼吸作用處于主導地位，反應器運行10 d后污泥濃度急劇下降至45.34 g·L-1，在HRT=9 h階段反應器污泥濃度最低下降到39.29 g·L-1.但HRT=6 h時，隨著污泥負荷的增加，系統微生物量呈現增加狀態，污泥濃度回升至46.15 g·L-1.在本實驗條件下，HRT=6 h可以確保SCAR系統污泥具有良好的穩定性，同時實現對污染物具有較高的去除效率.
2.2.2 顆粒污泥SMA與輔酶F420的比較
輔酶F420和產甲烷活性 (SMA) 是衡量產甲烷菌數量和活性的重要指標;不同HRT條件下反應器主體反應區 (A區) 和精細反應區 (D區) 污泥的輔酶F420和SMA變化情況見圖 4.
圖 4 不同停留時間下顆粒污泥的產甲烷活性和輔酶F420含量
由圖 4可見，反應器啟動運行后，在適應期主體反應區 (A區) 和精細反應區 (D區) 微生物輔酶F420和SMA均出現降低.而隨著反應器的運行，微生物逐漸適應了新環境，隨著HRT的減少和容積負荷的增加，輔酶F420和SMA基本是逐漸增加趨勢 (除HRT由6 h縮短至4 h時，精細反應區的輔酶F420有所降低;可能是反應時間太短，來不及反應的酸性物質累積對輔酶F420產生了抑制作用).一方面，污泥負荷的增加為微生物代謝提供了更多的代謝基質，促進了顆粒污泥活性的提高，另一方面，顆粒污泥粒徑的變化也同樣影響著污泥活性，適當的粒徑分布既可以保證產甲烷細菌的固定化狀態，也有利于代謝基質和厭氧代謝產物向顆粒污泥內部和外部的輸送.在圖 4中，反應器上部 (D區) 的SMA和輔酶含量顯著高于底部 (A區)，精細反應區的設置強化了反應器的產甲烷作用.
2.2.3 各階段顆粒污泥的EPS比較
胞外聚合物 (EPS) 是由微生物分泌的一種復雜高分子混合物，主要成分是多糖 (PS)、蛋白質 (PN)、核酸等大分子物質.對于厭氧顆粒污泥而言，EPS在顆粒污泥的形成和維持顆粒污泥結構穩定性方面起著重要作用.實驗期間，反應器穩定運行時不同HRT條件下厭氧顆粒污泥EPS[包括黏液層EPS (S-EPS)、松散附著EPS (LB-EPS)、緊密黏附EPS (TB-EPS)]含量狀況見圖 5.
圖 5 接種污泥和反應器不同HRT條件下污泥EPS的含量
由圖 5可見，反應器啟動運行后，顆粒污泥EPS含量較接種污泥出現較大幅度降低，隨著反應器容積負荷的提高，顆粒污泥EPS含量基本呈現增長態勢，特別是TB-EPS增長明顯.在HRT=15 h運行條件下，污泥負荷低，在微生物營養嚴重不足條件下，3種EPS均可以作為營養源供給微生物的新陳代謝作用，此時反應器中顆粒污泥的EPS含量與接種泥相比明顯減少，其中TB-EPS含量下降到最低的4.48 mg·g-1;污水較大上升流速形成的水力沖刷也為EPS的流失提供了條件.隨著反應器污泥負荷逐漸增大，顆粒污泥S-EPS、LB-EPS、TB-EPS濃度均不斷增加，營養條件的改善是顆粒污泥EPS濃度增加的主要原因.
TB-EPS位于顆粒污泥內部，對于維系細胞間良好黏附能力和保證顆粒污泥穩定性作用明顯.隨著容積負荷的增加，TB-EPS含量較HRT=15 h時的4.48 mg·g-1有明顯增長，在HRT=4 h時提高至10.19 mg·g-1.顆粒污泥的穩定性同時也受到EPS中PN和PS比值的影響，在反應器運行的前4個階段 (HRT為15、12、9和6 h)，隨著污泥負荷的不斷提高，EPS中蛋白質含量逐漸上升，多糖含量變化并不明顯，PN/PS比值逐漸增高，這4個運行階段中顆粒污泥性狀逐漸改善;當HRT=4 h時，EPS中多糖含量顯著增加導致PN/PS的比值明顯降低，其中TB-EPS中PN/PS的比值由HRT=6 h時的4.36下降到1.27，此時的反應器運行效果明顯變差.在HRT=4 h條件下，LB-EPS含量增加特別明顯，由HRT=6 h時的2.07 mg·g-1提高至5.38 mg·g-1，較豐富的營養物質使微生物代謝能力增強，分泌出更多的EPS，但是LB-EPS中多糖含量的增加，多糖的親水特性不利于顆粒污泥的沉降，使細小污泥易于被水流帶出反應器.
2.3 不同負荷條件下微生物群落的高通量測序分析
為了探究容積負荷對反應器中微生物群落分布的影響，分別對反應器接種污泥HRT=12 h及HRT=6 h條件下反應器的主體反應區和精細反應區污泥樣本進行高通量測序分析，結果如圖 6、圖 7;圖 8為HRT=12 h和HRT=6 h條件下，反應器不同高度處的乙酸濃度.
A1:HRT=12 h, A區;D1:HRT=12 h, D區;A2:HRT=6 h, A區;D2:HRT=6 h, D區
圖 6 細菌門的相對豐度
A1:HRT=12 h, A區;D1:HRT=12 h, D區;A2:HRT=6 h, A區;D2:HRT=6 h, D區
圖 7 古菌屬的相對豐度
圖 8 SCAR不同高度下的乙酸含量
由圖 6可見，在接種污泥的細菌門水平菌群分布中，主要有綠彎菌 (Chloroflexi)、擬桿菌 (Bacteroidetes)、厚壁菌 (Firmicutes)、變形菌 (Proteobacteria) 等優勢菌，隨著水力停留時間的改變，這些細菌始終保持優勢地位.通常認為優勢細菌的相對豐度會隨反應器的空間位置及負荷的升高而改變，如Ambuchi等研究EGSB (expanded granular sludge bed) 處理制糖廢水時發現在反應器的底部和上部的主要優勢菌種分別是綠彎菌 (Chloroflexi) 和厚壁菌 (Firmicutes);而Liao等研究EGSB處理高氮廢水時主要優勢菌種為變形菌 (Proteobacteria).本研究中，當HRT由12 h縮短至6 h時 (圖 6中)，反應器主體反應區的綠彎菌 (Chloroflexi) 優勢在減弱，相對豐度由開始的28.89%降低16.49%，而變形菌 (Proteobacteria) 的優勢在增強，相對豐度由開始的17.96%提高至26.43%，反應器精細反應區菌群分布也有相同變化趨勢.可能的原因有二，其一是綠彎菌 (Chloroflexi) 是嚴格厭氧細菌，隨著進水流量的增加，進水中少量溶解氧可能對綠彎菌 (Chloroflexi) 產生抑制作用，但對于變形菌門細菌來說，兼性環境對其生長有促進作用;其二是實驗條件下變形菌 (Proteobacteria) 較綠彎菌 (Chloroflexi) 世代時間短，在較充分營養條件下實現了更多增殖.
反應器接種污泥中古菌的優勢菌分布較廣，在古菌的屬水平分布中，主要有甲烷鬢菌屬 (Methanosaeta sp.，相對豐度為36.2%)、甲烷繩菌屬 (Methanolinea sp., 相對豐度為29.1%)、甲烷八疊球菌屬 (Methanosarcina sp.，相對豐度為9.7%)、第七產甲烷古菌屬 (Methanomassiliicoccus，相對豐度為4.2%)、甲烷桿菌屬 (Methanobacterium，相對豐度為4.9%) 以及其它一些菌屬.實驗期間，甲烷鬢菌屬 (Methanosaeta sp.) 和甲烷繩菌屬 (Methanolinea sp.) 一直為主要優勢菌種，二者相對豐度之和大于50%，甚至超過80%. Chelliapan等的研究也顯示厭氧反應器的容積負荷范圍為0.86~1.86 kg·(m3·d)-1時甲烷鬢菌是反應器運行過程中的主導微生物.甲烷鬢菌 (Methanosaeta) 是一種典型的乙酸營養型細菌，對厭氧反應器的穩定運行起著重要作用.當HRT=12 h，進水容積負荷較低，營養不足，反應器上部乙酸含量較少，甲烷鬢菌屬 (Methanosaeta) 很難利用到乙酸底物，相對豐度降至16.08%，優勢逐漸減弱，當HRT=6 h，容積負荷提高，反應器上部的乙酸含量明顯增加，甲烷鬢菌屬 (Methanosaeta) 又恢復成為絕對的優勢菌種 (相對豐度為75.58%). Siggins等研究EGSB反應器處理三氯乙烯廢水發現，VFA (主要是乙酸) 出現積累時甲烷鬢菌 (Methanosaeta) 是主導微生物.在圖 8中，兩種負荷條件下SCAR反應器主體反應區的乙酸含量均較高 (均超過80 mg·L-1)，主體反應區內甲烷鬢菌屬 (Methanosaeta) 相對豐度在兩種負荷條件下幾乎相同，而精細反應區的乙酸含量差別較大，在2 m高度處、HRT=12 h條件下乙酸僅為約15 mg·L-1，而HRT=6 h條件下乙酸濃度約為40 mg·L-1，對應著后者條件下精細反應區內甲烷鬢菌屬 (Methanosaeta) 相對豐度遠高于前者，由此可見，當乙酸濃度小于某一濃度時 (本實驗為15 mg·L-1)，甲烷鬢菌屬 (Methanosaeta) 相對豐度會產生巨大變化. Wang等[35]研究EGSB處理養豬廢水時容積負荷提高到10 kg·(m3·d)-1，乙酸營養型產甲烷菌才能轉化成氫營養型產甲烷菌.但本研究中，甲烷繩菌屬 (Methanolinea) 屬于氫營養型產甲烷菌，較低負荷條件下反應器產生的乙酸量較少，乙酸營養型產甲烷鬢菌 (Methanosaeta) 很難占據主導地位，氫營養型甲烷繩菌優勢地位明顯.
不同負荷條件下、反應器不同反應區菌群分布的差異，說明反應器在空間上實現了微生物功能分區，即微生物相分離;結合圖 4中反應器主反應區產甲烷活性 (SMA) 和輔酶F420低于上部精處理區的現象，證明了厭氧反應器設置精處理區的重要性和必要性.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。
3 結論
(1) SCAR處理生活污水，污水在反應器中的上升流速為4 m·h-1，在30℃條件下連續運行.隨著反應器容積負荷的提高，顆粒污泥產甲烷活性 (SMA) 和輔酶F420活性均增加，而且反應器上部厭氧污泥活性明顯高于底部.在HRT=6 h、容積負荷為1.77 kg·(m3·d)-1條件下，COD去除率能達到75%以上，顆粒污泥性狀良好;當HRT縮短至4 h，反應器出水中VFAs出現積累，水質惡化.
(2) 隨著容積負荷的提高，顆粒污泥的平均粒徑有逐漸變小趨勢，但φ1~2 mm的污泥比例逐漸增多，粒徑分布最終趨于穩定.顆粒污泥胞外聚合物 (EPS) 含量不斷增加，尤其是TB-EPS增加明顯，較充分的營養條件和對污染物良好的去除效率，使EPS中的蛋白質 (PN) 含量顯著增加.
(3) 污泥樣品的高通量測序分析表明，容積負荷的改變不僅影響著微生物菌落的結構分布，而且也改變著不同微生物在反應器的空間分布.隨著污泥負荷的增加，細菌門水平菌群分布中綠彎菌 (Chloroflexi) 的優勢地位在減弱，變形菌 (Proteobacteria) 的優勢地位在增強，而古菌的菌群分布中甲烷繩菌屬 (Methanolinea sp.) 優勢位置逐漸減弱，甲烷鬢菌屬 (Methanosaeta sp.) 優勢地位逐漸增強.
