再生水回用是解決城市水資源危機的必然途徑.作為再生水水源的城市污水處理廠尾水中仍有一定濃度的氮、磷含量，嚴(yán)重影響再生水的品質(zhì)及其使用價值.因此為了確保再生水品質(zhì)有必要對城市污水處理廠尾水進(jìn)行深度脫氮除磷處理.然而城市污水處理廠尾水存在C/N比低和工藝實現(xiàn)同步脫氮除磷較為困難等問題.

　　固相纖維素碳源玉米芯因?qū)崿F(xiàn)了低C/N比尾水深度反硝化脫氮而備受關(guān)注.然而，單純以玉米芯作為反應(yīng)器填料難以實現(xiàn)反硝化脫氮同步高效除磷.有研究表明，硫磺與海綿鐵混合而成的硫鐵復(fù)合填料在低C/N比尾水深度脫氮除磷方面具有獨特的優(yōu)勢.將纖維素碳源玉米芯與硫鐵復(fù)合填料有機結(jié)合構(gòu)造出固相纖維素碳源+硫鐵填料脫氮除磷復(fù)合系統(tǒng) (solid carbon source of cellulose and sulfur/sponge iron process，SCSC-S/Fe復(fù)合系統(tǒng))，將實現(xiàn)低C/N比尾水深度反硝化脫氮同步除磷的目的.

　　溫度是影響微生物生命活動的重要因素之一.在一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高胞內(nèi)酶活性、細(xì)胞膜的流動性逐漸增強，微生物種群數(shù)量增多.趙文莉等研究發(fā)現(xiàn)，作為反硝化濾池濾料的玉米芯表面主要附著纖維素類降解菌和反硝化細(xì)菌.玉米芯中的纖維素、半纖維素被纖維素類降解菌分解成小分子有機物，為異養(yǎng)反硝化細(xì)菌脫氮提供有機碳源.有研究表明，溫度對纖維素降解和反硝化脫氮過程影響較大.目前，關(guān)于溫度對纖維素類降解菌和反硝化細(xì)菌影響差異的研究鮮有報道.因此，了解纖維素類降解菌和反硝化細(xì)菌對溫度變化的敏感程度，掌握纖維素類物質(zhì)作為碳源進(jìn)行反硝化脫氮時的適宜溫度，可為更好地利用纖維素碳源提供理論基礎(chǔ).

　　本研究針對城市污水處理廠低C/N比尾水深度脫氮除磷問題，探究不同溫度下SCSC-S-Fe復(fù)合系統(tǒng)脫氮同步除磷效果，通過掃描電鏡 (SEM) 對初始態(tài)玉米芯及反應(yīng)后不同溫度下玉米芯表面微生物附著情況，并結(jié)合細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫來分析玉米芯表面微生物種群特性，分析了溫度對反硝化細(xì)菌和纖維素降解細(xì)菌影響的敏感程度，以期為城市污水處理廠尾水深度脫氮除磷提供技術(shù)參考.

　　1 材料與方法1.1 實驗裝置

　　實驗裝置如圖 1所示，SCSC-S/Fe復(fù)合系統(tǒng)主要由異養(yǎng)反硝化脫氮濾柱 (A柱) 和硫鐵填料脫氮除磷濾柱 (B柱) 組成，均為有機玻璃材質(zhì)，內(nèi)徑19 cm，高度100 cm，有效容積分別為5 L和5.3 L. A柱填充由尼龍絲網(wǎng)包裹著氫氧化鈉處理過的玉米芯，填充高度為45 cm，其中將玉米芯切割成長寬高約為3 cm×1 cm×1 cm的小長方體. B柱上層裝有高度為50 cm質(zhì)量比為2:3的粒徑為2~3 mm硫磺和粒徑3~5 mm海綿鐵復(fù)合填料;下層用粒徑為5~8 mm的石灰石填裝作為過濾層，有效高度為40 cm. A、B柱水流方式分別為上向流和下向流.

圖 1 SCSC-S/Fe實驗裝置示意

　　1.2 實驗水質(zhì)

　　實驗用水為在自來水中加入KNO3、KH2PO4模擬城市污水處理廠尾水中的TN和TP含量，并用1 mol ·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH值.該水水質(zhì)特征為：ρ(NO3--N)33~36mg ·L-1，ρ(TP) 1.4~1.6 mg ·L-1，pH 6.8~7.2.

　　1.3 實驗方法與分析指標(biāo)

　　反應(yīng)器采用接種掛膜法啟動，接種污泥來自北京某污水處理廠回流污泥，具體參考李素梅等[12]提供的反應(yīng)器啟動方法.待出水水質(zhì)各項指標(biāo)趨于穩(wěn)定后，啟動過程完成.控制水力停留時間 (HRT) 為9 h不變，其中A柱的HRT=3 h，B柱的HRT=6 h.實驗設(shè)定4個溫度梯度：15、20、25和30℃.每次變更條件后，穩(wěn)定一周后再開始對A柱進(jìn)、出水和B柱出水取樣檢測，實驗穩(wěn)定運行127 d.當(dāng)溫度20℃和30℃做完后，分別提取反應(yīng)器中部玉米芯表面生物膜，具體微生物MiSeq高通量測序過程及分析方法參考郝瑞霞等[13]提供的操作步驟和分析方法.檢測項目包括進(jìn)出水NO3--N、NO2--N、NH4+-N、SO42-、TN、TP、TFe、COD和pH值. 表 1列出分析項目與分析儀器.

　　表 1 分析項目與儀器

　　2 結(jié)果與討論2.1 不同溫度下復(fù)合系統(tǒng)脫氮除磷效果2.1.1 反硝化脫氮效果及分析

　　圖 2為不同溫度下該系統(tǒng)NO3--N及TN去除情況.從中可知，溫度從15、20、25℃升高30℃時，系統(tǒng)TN平均去除率分別為78.88%、88.62%、90.43%和92.70%;NO3--N去除率變化不明顯;系統(tǒng)出水NO3--N濃度從0.8mg ·L-1左右逐漸降低到0 mg ·L-1，出水NO2--N濃度從3.53 mg ·L-1逐漸降低到0.49mg ·L-1左右，NH4+-N濃度從3.23mg ·L-1逐漸降低到2.08 mg ·L-1左右;A柱TN去除量隨溫度升高逐漸增加，從4.58 mg ·(L ·h)-1增加到6.91 mg ·(L ·h)-1左右, B柱TN去除量變化不明顯.數(shù)據(jù)表明，溫度從15℃升高到20℃時，系統(tǒng)TN去除率增加10%，從20℃升高到30℃過程中變化不明顯;出水中的氮主要以NO2--N、NH4+-N形式存在;A、B柱共同作用將系統(tǒng)內(nèi)硝酸鹽氮去除，A柱TN去除量隨溫度升高逐漸增加.

(a) 系統(tǒng)TN、NO3--N去除率及出水TN濃度; (b) 系統(tǒng)出水NO3--N、NO2--N和 NH4+-N濃度; (c) A、B柱TN去除量

圖 2 SCSC-S-Fe復(fù)合系統(tǒng)不同溫度下硝酸鹽及總氮去除情況

　　SCSC-S/Fe復(fù)合系統(tǒng)中存在異養(yǎng)反硝化、硫自養(yǎng)反硝化、氫自養(yǎng)反硝化和零價鐵的化學(xué)還原作用等脫氮作用.硫自養(yǎng)反硝化、氫自養(yǎng)反硝化和零價鐵的還原作用可以有效彌補異養(yǎng)反硝化過程中碳源的不足.有研究表明[14, 15]，在反硝化脫氮過程中，多種脫氮作用混合條件下系統(tǒng)的脫氮能力比單一反硝化作用更強.因此，SCSC-S/Fe復(fù)合系統(tǒng)具有高效的反硝化脫氮效率.

　　2.1.2 除磷效果

　　圖 3為該系統(tǒng)在不同溫度下除磷情況.從中可知，溫度逐漸升高過程中，系統(tǒng)TP平均去除率從15℃的82.95%逐漸升高到30℃的89.15%，出水TP濃度從0.3mg ·L-1降低到0.2mg ·L-1左右;A柱占系統(tǒng)除磷比例的10%，B柱占90%左右.數(shù)據(jù)表明，SCSC-S/Fe復(fù)合系統(tǒng)具有較高的除磷效率，TP去除率隨溫度升高而增加，系統(tǒng)中的磷主要在B柱內(nèi)去除.

(a) 系統(tǒng)TP去除率及出水TP濃度;(b) A、B柱對系統(tǒng)除磷的貢獻(xiàn)比例

圖 3 SCSC-S/Fe復(fù)合系統(tǒng)除磷情況

　　2.2 玉米芯表面SEM分析

　　為了探究玉米芯表面微生物附著特性及對比其表面反應(yīng)前后的變化，對初始玉米芯及反應(yīng)后不同溫度的玉米芯表面進(jìn)行掃面電子顯微鏡 (SEM) 分析.

　　根據(jù)權(quán)曉琴等的研究，玉米芯橫截面的顯微結(jié)構(gòu)主要由內(nèi)部的纖維管束和外部表層結(jié)構(gòu)組成，其中纖維管束主要由纖維素和半纖維素組成，而外部表層主要由木質(zhì)素和纖維素構(gòu)成. 圖 4為初始態(tài)玉米芯及內(nèi)外組織掛膜反應(yīng)后的掃描電鏡圖.對比圖 4(a)和4(b)可知，30℃時微生物已將玉米芯內(nèi)部纖維管束分解為細(xì)絲狀，其周圍組織附著大量球狀微生物，也有少量的桿狀微生物，說明玉米芯纖維管束有利于微生物附著分解.從圖 4(c)和4(d)可知，玉米芯表層組織均勻附著球狀微生物，將玉米芯表面降解為一些孔洞，30℃時表層附著的微生物和孔洞數(shù)量要比20℃時多，30℃時玉米芯表層有些地方已被微生物分解成較大的孔洞.據(jù)報道，反硝化細(xì)菌和纖維素類降解菌均以桿狀、球狀微生物為主，本研究中玉米芯表面微生物存在形態(tài)與文獻(xiàn)報道基本一致.除此之外，對比玉米芯表層和內(nèi)部組織的生物降解程度可知，玉米芯內(nèi)部纖維管束結(jié)構(gòu)更易于微生物降解.因此玉米芯作碳源時應(yīng)將其切割纖維管束暴露出來.

圖 4 反應(yīng)前后玉米芯掃描電鏡圖片

　　2.3 微生物種群特性分析2.3.1 樣品合理性分析

　　為了更好地分析溫度對纖維素類降解菌和反硝化細(xì)菌敏感程度，分別在20℃和30℃條件下提取玉米芯表面生物膜，運用細(xì)菌MiSeq高通量測序技術(shù)，分別獲得25 827和31 272條優(yōu)化序列，將優(yōu)化后的序列在相似性為97%條件下歸為一個操作單元 (OTU)，分別得到250和376個OTUs.常用覆蓋度指數(shù)和樣品稀釋Shannon曲線來表征樣品取樣的合理性.覆蓋度指數(shù)越大表明序列被檢測出來的概率越高;稀釋曲線隨著測序序列越趨向平坦越表明取樣合理.本研究樣品的覆蓋度指數(shù)均為0.998 048，樣品的稀釋曲線如圖 5所示，結(jié)果表明本研究中樣品合理.

圖 5 樣品的Shannon曲線

　　2.3.2 微生物種群特性分析

　　為得到每一種微生物的詳細(xì)信息，將得到的OTUs與Silva庫對比聚類，結(jié)合分類學(xué)分析方法，分別在門 (phylum) 和屬 (genus) 分類水平下聚類分析樣本群落特性，其結(jié)果如圖 6所示.

圖 6 A柱內(nèi)微生物分布情況

　　從圖 6(a)可知，樣品分類后共得到6種已知菌門，Proteobacteria (變形菌門) 在20℃和30℃條件下均為比例最大的菌門，其相對豐度分別為60%和44.72%，變形菌門中大部分微生物趨向于在厭氧環(huán)境下通過分解有機物進(jìn)行反硝化脫氮過程;Bacteroidetes (擬桿菌門) 中大多數(shù)細(xì)菌可以將纖維素降解成可溶性糖類，其相對豐度分別為19.46%和24.53%;Firmicute (厚壁菌門) 中大多數(shù)細(xì)菌可以參與污泥反硝化脫氮過程，其相對豐度分別為13.29%和7.31%;Acidobacteria (酸桿菌門) 相對豐度分別為0.31%和3.85%，這類細(xì)菌可以將纖維素、半纖維素降解成可溶性糖類和有機酸;Spirochaetae (螺旋菌門) 是一類可以專一降解半纖維素的細(xì)菌，其相對豐度分別為1.88%和12.84%;Fibrobacteres (纖維桿菌門) 細(xì)菌細(xì)胞周質(zhì)中含有纖維素酶可以分解纖維素，其相對豐度分別為0.56%和2.0%.數(shù)據(jù)表明，30℃條件下降解纖維素、半纖維素有關(guān)的菌屬占已知細(xì)菌菌屬的43.22%，比20℃時高出11.01%;30℃條件下與反硝化有關(guān)菌屬占已知細(xì)菌菌屬的52.03%，比20℃下降了21.26%.下文將從細(xì)菌屬水平更詳細(xì)地探討溫度對微生物種群特性的影響.

　　圖 6(b)為微生物在屬水平特性分布情況，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道具有降解纖維素或反硝化脫氮作用相關(guān)的菌屬，其功能及所占的比例如表 2所示.玉米芯表面生物膜中與反硝化脫氮有關(guān)的主要菌種包括：Rhodocyclaceae (紅環(huán)菌科)、Dechloromonas菌屬、Comamonadaceae (叢毛單胞菌科)、Zoogloea(動膠菌屬)、Thauera(陶厄氏菌) 和Blvii28_wastewater-sludge_group菌屬，在20℃時這些菌屬占已知微生物菌屬的35.63%，比30℃時所占比例高出7.88%.生物膜中與纖維素降解有關(guān)的主要有Treponema_ 2菌屬、Paludibacter(沼桿菌屬)、Bacteroides(擬桿菌屬) 和Spirochaetaceae (螺旋體科)，在20℃時其所占比例為已知菌屬的4.42%，比30℃時低13.87%.

　　表 2 樣本中主要菌屬的功能及其所占比例

　　可見，溫度從20℃升高到30℃時，反硝化細(xì)菌所占已知微生物菌屬的比例降低，纖維素類降解菌所占的比例增加，表明降解纖維素類細(xì)菌隨溫度升高比反硝化細(xì)菌增長更快，受溫度影響更大.

　　2.3.3 溫度對系統(tǒng)內(nèi)具有除磷作用微生物的影響

　　玉米芯表面附著具有反硝化聚磷作用的Rhodocyclaceae菌科和Dechloromonas菌屬，可見A柱依靠生物除磷作用將磷去除，生物除磷作用包括反硝化聚磷作用和微生物生長代謝吸收作用.如表 2所示，在20℃和30℃條件下，Rhodocyclaceae菌科和Dechloromonas菌屬所占比例變化不大，分別為20.22%和19.56%.可見，溫度從20℃升高到30℃過程中，該系統(tǒng)中具有除磷作用的微生物種群所占比例幾乎不變.

　　2.4 反硝化細(xì)菌和纖維素降解細(xì)菌對溫度的敏感程度

　　從微生物種群特性部分可知，填裝玉米芯的A柱存在纖維素類降解菌和反硝化細(xì)菌，纖維素類降解菌將纖維素、半纖維素分解成利于異養(yǎng)反硝化細(xì)菌利用的可溶性糖類，此過程中產(chǎn)生的有機酸有助于維持體系pH值穩(wěn)定，出水pH值和COD濃度如圖 7所示.

圖 7 A柱pH值及出水COD濃度

　　為了探究溫度對纖維素類降解菌和反硝化細(xì)菌的影響程度大小，通過纖維素降解產(chǎn)生的COD與反硝化消耗的COD之間的比例系數(shù)η進(jìn)行分析，即：

　　其中纖維素降解產(chǎn)生的COD (COD總) 包括A柱進(jìn)、出水COD的差值 (ΔCOD) 和反硝化脫氮消耗COD (COD消耗)，即COD總=ΔCOD+COD消耗，以上計算均取每個溫度下的平均值.有研究表明，在反硝化系統(tǒng)中異養(yǎng)反硝化脫氮作用大小可以用COD的消耗量來表征，理論上異養(yǎng)反硝化每將1 gNO3--N還原成N2需要消耗2.86 g COD，如果考慮微生物同化產(chǎn)能和氧化消耗的COD，實際上反硝化所需的C/N比在3以上，本研究取C/N比等于3, 其計量關(guān)系如公式 (1) 所示.根據(jù)圖 7中A柱進(jìn)、出水NO3--N濃度差 (ΔNO3--N) 和公式 (1) 計算出A柱反硝化脫氮過程中COD消耗，進(jìn)而計算出η值，結(jié)果如圖 8(b)所示.從中可知，隨溫度升高η值逐漸增大，表明隨溫度升高微生物降解纖維素產(chǎn)生的有機物速率大于反硝化脫氮消耗速率，即纖維素類降解細(xì)菌比反硝化細(xì)菌隨溫度升高增長更快、受溫度影響更大.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

圖 8 A柱COD濃度和η值

　　3 結(jié)論

　　(1) SCSC-S/Fe復(fù)合系統(tǒng)能高效地將城市污水處理廠低C/N比尾水中的氮、磷去除.該系統(tǒng)TN去除率隨溫度升高逐漸增加，溫度從15、20、25℃升高到30℃時，TN平均去除率從78.88%增加到92.70%;TP去除率隨溫度升高增加不明顯，保持在82%以上.

　　(2) 玉米芯中的纖維管束結(jié)構(gòu)易被微生物分解利用，將玉米芯纖維管束結(jié)構(gòu)切割暴露后便于微生物利用.

　　(3) 溫度從20℃升高到30℃時，與反硝化有關(guān)的Proteobacteria菌門和Firmicute菌門所占比例分別降低了15.28%和5.98%，同時纖維素、半纖維素降解有關(guān)的Bacteroidetes菌門、Acidobacteria菌門、Spirochaetae菌門和Fibrobacteres菌門細(xì)菌所占比例增加了11.01%.因此，纖維素類降解細(xì)菌比異養(yǎng)反硝化細(xì)菌隨溫度升高增長更快、對溫度升高更敏感和受溫度影響更大.

　　(4) 溫度從20℃升高到30℃過程中，玉米芯表面與生物除磷作用有關(guān)的Rhodocyclaceae菌科和Dechloromonas菌屬占已知菌屬的比例從20.22%變化到19.56%.可見，在一定范圍內(nèi)，溫度變化對固相纖維素碳源的生物除磷過程影響不大.