BOD5測定通常采用標準稀釋與接種法（GB 7488--87），其操作為，經中和及除去毒性物質并經稀釋后的水樣（必要時加入適量含好氧微生物的接種液）置入培養瓶中，于在20oC暗處培養5d，通過分別測定培養前后水樣中溶解氧的含量，來計算出5d內的耗氧量，再根據稀釋倍數求得其BOD5。

BOD5的測定是生物作用和化學作用的共同結果，必須嚴格按照操作規范進行，變更任何一個條件，都將影響測定結果的準確性和可比性。影響BOD5測定的條件包括pH值、溫度、微生物種類和數量、無機鹽含量、溶解氧和稀釋倍數等。