1 引言
活性污泥是微生物與懸浮物質、膠體物質混凝交織在一起所形成的絮狀物質，它的結構和功能的中心是菌膠團.在菌膠團上，生長著細菌、真菌、原生動物和某些后生動物，這些微生物能分泌具有粘著性的膠狀物質，對微小顆粒和可溶性有機物有強烈的吸附能力，在水流的作用下與懸浮顆粒相碰撞、粘連，形成活性污泥絮體.通過重力作用進行泥水分離是活性污泥處理系統中的重要環節，污泥的沉降性能決定了處理工藝的整體效率.已經被研究的影響污泥沉降性能的主要因素包括：絲狀菌含量、絮體的粒徑分布、絮體的表面電荷和絮體的親疏水性等.目前普遍認為，絲狀菌數量增多時，絮體變得松散.絮體的表面凈負電荷可以在絮體之間產生排斥勢能，使絮體難以進一步接觸凝聚.絮體的親疏水性決定了其內部的含水率，含水率越高污泥比重越小.胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substance，EPS)是微生物所分泌的覆蓋在細菌細胞壁外的高分子物質，它的含量和組成對活性污泥的絮體結構、表面電荷、親疏水性和沉降性能都有很大影響.此外，微生物群落結構也是影響活性污泥處理系統正常運行的重要因素.微生物種群豐富意味著其內部貯存著可以在不同環境下生長具有不同特性的微生物，因此，可以抵抗環境的劇烈變化.微生物種群豐富強化了其對特定功能的保持及對沖擊負荷的快速恢復能力，同時豐富了基質的利用途徑.
在生物流化床處理工程泥水分離區中，基于不同流體運動速度，污泥相存在比重方面的差異，密實型絮團沉在底部，顆粒大，而在反應器的頂部，通常會出現少量污泥游離于上清液中難以沉降.因此，可以通過沉降作用或流體力場分離作用實現基于上述現象污泥的異質性分離，由此，本文把通過異質性分離得到的沉降速度快慢不同的污泥分別定義為聚結型污泥與離散型污泥，探究所分離的污泥在活性、胞外聚合物與微生物群落結構方面是否存在內部相關性.離散型污泥與聚結型污泥相比，其絮體顆粒更小，結構更松散.目前還沒有發現針對生物流化床處理系統活性污泥的這種異質性加以研究的文獻報道.為了初步考察聚結型污泥與離散型污泥的活性差異，本文采用連續穩定運行3年以上的焦化廢水處理工程好氧工藝的混合液作為研究對象，該生物處理單元采用流化床結構，生物流化床通過置入軸向內導流筒使氣液固三相在反應器內循環運動.混合液在強大的氣流沖擊性下呈流化態，因此，污泥呈絮體狀.利用旋流離心的方法分離出離散型絮狀污泥，以聚結型絮狀污泥作為對照，在異質性方面考察兩種污泥在EPS、微生物活性和微生物群落結構方面的差異.其中，微生物活性用有機物平均降解速率和比耗氧速率來表征.上述研究工作的動機是，若能夠證明在廢水生物處理工程中存在污泥的異質性，而又可以通過工程手段應用污泥的異質性，則有可能調控生物處理系統使之處于污泥性質分配功能化的過程，有選擇性地從反應器中識別污泥齡長的老化污泥，由此保持系統內的高活性.
2 材料與方法
2.1 污泥的采集與分離
本研究采集的水樣與活性污泥樣品均來自寶鋼集團廣東韶鋼焦化廠酚氰廢水處理站，該廢水處理站始建于2004年，由本團隊提供技術并設計，生物處理水量為70~80 m3 · h-1，處理出水穩定在《煉焦化學工業污染物排放標準》(GB16171—2012)限值以內.本研究從二級好氧池采集泥水混合液20 L，將混合液倒入水桶中，使用木棒緩慢攪動，利用離心作用分離污泥.從水桶邊緣采集到的污泥為比重更大的聚結型污泥，從水桶中央采集到的污泥為比重更輕的離散型污泥.采集污泥后立即測定污泥常規指標.
2.2 有機物降解實驗
通過比較兩種污泥的有機物降解速率來考察微生物活性的差異，具體做法為：通過離心機將聚結型污泥與離散型污泥脫水，得到含水率基本一致的濕污泥.將焦化廢水原水稀釋1倍，調節pH至7.0~7.5，按C ∶ N ∶ P=100 ∶ 5 ∶ 1的比例添加KH2PO4，獲得實驗廢水.搖瓶實驗設置4組對照組，所添加的濕污泥分別為3.0、6.0、9.0、12.0 g.投加配制好的實驗廢水250 mL，搖勻后立即從各搖瓶中取混合液100 mL測定MLSS和MLVSS. 隨后用薄膜和紗布封口，放入搖床中，溫度和轉速分別設為(30.0±1.0)℃和200 r · min-1.定時取樣檢測COD和TOC濃度，有機物平均降解速率按式(1)和(2)計算.
式中，[COD]0、[TOC]0和[COD]t、[TOC]t分別為某一時間段內初始時和終止時的COD和TOC濃度(mg · L-1)，t為間隔時間(h)，[MLVSS]為揮發性懸浮固體濃度(mg · L-1).
2.3 測試方法 2.3.1 常規指標
pH值、COD、MLSS、MLVSS均參照《水和廢水監測分析方法(第4版)》測定，TOC采用島津TOC-VCPH測定. 2.3.2 胞外聚合物(EPS)取2.1節中分離得到的聚結型污泥與離散型污泥各50 mL，在4 ℃下以5000 r · min-1離心20 min，得到污泥上清液經0.22 μm濾膜過濾，用于Soluble EPS的測定.棄去剩余上清液，以蒸餾水補足到原體積，充分混勻后加蓋密封，在80 ℃恒溫水浴鍋中加熱40 min后，在4 ℃下以5000 r · min-1轉速離心20 min，得到上清液經0.22 μm濾膜過濾，用于Bound EPS的測定. EPS中的多糖與蛋白質的測定分別采用硫酸苯酚法和考馬斯亮藍G-250染色法.
2.3.3 比耗氧速率
將2.1節中分離得到的聚結型污泥與離散型污泥悶曝2 h，取20 mL污泥于血清瓶中，添加20 mL已配制好的焦化廢水原水和80 mL已曝氣至飽和溶氧狀態的蒸餾水，置于恒溫磁力攪拌裝置中，用磁力攪拌器將污泥混勻，溫度控制在(25.0±1.0)℃.密封瓶口，在線記錄DO變化曲線.內源呼吸對照組則不添加焦化廢水原水，直接添加100 mL已曝氣至飽和溶氧狀態的蒸餾水.測試結束后，測定污泥MLVSS并按式(3)計算比耗氧速率(SOUR).
式中，[DO]0、[DO]t分別為測定初始時和終止時的溶解氧濃度(mg · L-1)，t為測定時間(h)，[MLVSS]為揮發性懸浮固體濃度(mg · L-1).
2.4 微生物群落結構分析 2.4.1 基因組DNA的提取
將2.1節中分離得到的兩種污泥抽濾脫水獲得干污泥，各取100.0 mg干污泥，使用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)，通過Buffer SCL裂解樣品，釋放基因組DNA，然后通過Buffer SP和氯仿去除蛋白質的干擾. 抽提獲得的DNA樣品貯存于-20 ℃冰箱中，用于后續PCR擴增. DNA樣品用1.5%瓊脂糖凝膠進行檢測. 2.4.2 PCR擴增 總細菌的PCR擴增采用對大多數細菌和古細菌16S rDNA基因V3區都具有特異性的引物對F341-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGG CGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和R534(5′-ATTACCGCGGCTGCTG G-3′)，氨氧化菌的PCR擴增采用對氨氧化菌具有特異性的引物對CTO189f(5′-CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG GAGAAAAGCAGGGGATCG-3′)和CTO654r(5′-CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC-3′.反應采用50 μL體系：2 μL DNA模板，2 μL上游引物，2 μL下游引物，25 μL Taq PCR Master Mix，19 μL無核酸雙蒸水. PCR反應的產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行檢測.
2.4.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)
采用Bio-rad公司Dcode突變檢測系統對PCR反應產物進行分離，凝膠濃度為8%，變性劑濃度為30%~60%，溫度60 ℃，在60 V的電壓下電泳12 h. 結束后，將凝膠進行銀染，待條帶出現后拍照，在凝膠成像系統上成像檢測，獲得DGGE圖譜. 隨后用75%酒精消毒后的手術刀切下DGGE凝膠條帶，回收保存于200 μL薄壁管，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行克隆測序. 2.4.4 DGGE圖譜條帶分析 利用Quantity One軟件對DGGE圖譜中條帶的位置及強度進行模擬分析，得到各條帶的波峰面積，利用Shannon指數(H)來評價污泥樣品的微生物豐富程度，計算公式為：
式中，ni為峰面積，N為所有峰的總面積.
利用戴斯系數(Cs)評價污泥樣品之間微生物種群的相似性，計算公式為：
式中，j為泳道A和B的共有條帶的數量，a和b分別是泳道A和B中的條帶數.
將測序結果進行處理后提交到GenBank數據庫，采用BLAST進行目標序列和基因庫中所含序列的相似性分析，得到同源性最近的序列.
3 結果與討論(Results and discussion) 3.1 污泥形態與特性比較
通過旋流分離裝置分離得到聚結型污泥與離散型污泥后立即進行掃描觀察，結果如圖 1所示.由圖 1可知，兩種污泥均呈絮體狀，外型不規則.相比而言，聚結型污泥結構更為密實，絮體之間連接緊密，而離散型污泥絮團較小，結構更為松散.兩種污泥常規指標如表 1所示，離散型污泥與聚結型污泥SVI值分別為78.9與56.0 mL · g-1. SVI即污泥體積指數，是衡量活性污泥沉降性能的指標，聚結型污泥SVI值低于離散型污泥表明其污泥沉降性能更好，污泥比重更大.
采用2.3.2節中所述方法測定兩種污泥的胞外聚合物，結果如圖 2所示.胞外聚合物是微生物細胞分泌的粘性物質，主要成分為多糖和蛋白質等物質.其中，Bound EPS主要是緊密結合在細胞外殼的束縛性聚合物及附著有機物，Soluble EPS主要是可溶解的大分子物質、膠體和粘液. 數據顯示，離散型污泥單位質量MLVSS中的Bound EPS和Soluble EPS更高，這一結果與其他學者的研究結果相符.EPS的含量與污泥的沉降性能呈負相關.離散型污泥EPS含量更高，導致污泥表面電負性較大，絮體表面的凈負電荷可以在絮體之間產生排斥勢能，導致污泥結構變得松散.
3.2 污泥有機物降解速率及耗氧速率比較
設置4組不同污泥濃度的對照組(表 2)，添加配制好的實驗廢水，進行有機物降解實驗，計算得到COD、TOC平均降解速率如表 3和表 4所示.
COD與TOC存在一定的相關性，實驗結果中二者在數值和變化規律上基本吻合.結果表明，在最初的8 h中，降解速率較低，大部分有機物在8~20 h中得到降解.對照組1由于污泥濃度小，有機物負荷更高，因此，每克污泥有機質所降解的有機物更多，其降解速率最大值出現在16~20 h. 對照組2、3、4降解速率最大值出現在8~16 h. 在這個時間段中對照組1中離散型污泥降解速率更高，而在對照組2、3和4中聚結型污泥降解速率更高.由于微生物活性差異較小，因此，在對照組1和2中兩種污泥的有機物平均降解速率沒有明顯規律，而在高污泥濃度的對照組3和4中，有機物平均降解速率呈現的規律較為明顯，離散型污泥的有機物平均降解速率要低于聚結型污泥.
微生物內源呼吸是指在沒有其他基質可以利用的情況下微生物通過消耗內在儲存的物質完成生命活動，而外源呼吸是指在添加實驗廢水后微生物利用外界供給的物質進行代謝活動，此時內源呼吸并不顯著. 實驗所采集的污泥為好氧污泥，微生物在降解有機物和硝化過程中都要消耗氧氣.微生物的新陳代謝速率可以通過耗氧速率來反映.本文測定了兩種污泥在內源呼吸時和外源呼吸時的比耗氧速率，結果如圖 3所示.聚結型污泥無論是內源呼吸還是外源呼吸時的比耗氧速率都要高于離散型污泥，說明其微生物活性更高.
3.3 污泥中微生物群落結構分析
焦化廢水是由原煤的高溫干餾、煤氣凈化和化工產品精制過程中產生的一種成分極為復雜的廢水，除了氨、氰、硫氰根、氟化物等無機污染物外，還含有酚、油、胺、萘、吡啶、喹啉、蒽等雜環及多環芳香族化合物(PAHs). 在生物處理系統中多種微生物以廢水中有機物及無機成分為營養物質，在系統中大量繁殖，形成了較為穩定的生態系統.DGGE圖譜中處于不同位置的條帶代表一個可能的細菌類群或可操作分類單位(Operational Taxonomic Unit，OTU)，條帶越多說明生物多樣性越豐富，條帶染色后的熒光強度則反應該細菌的豐富度，條帶信號越亮，表示該種屬的數量越多，從而反映污泥中微生物的種類和數量.通過條帶的信號強度可以看出處于優勢地位的微生物種群.
總細菌DGGE圖譜如圖 4a所示，對比兩種污泥的微生物群落結構可以看出，離散型污泥與聚結型污泥內部微生物群落結構存在差異，二者的相似度以戴斯系數表示，為72.7%.在聚結型污泥DGGE泳道上觀察到40條不同的條帶，計算得到其Shannon指數為2.15. 在離散型污泥DGGE泳道上觀察到27條不同的條帶，其Shannon指數為1.55，表明聚結型污泥內部微生物種群更為豐富，而離散型污泥上所附著的微生物種類更少，某些微生物種群在離散型污泥中豐度很低，如B and 1、2、3、4、5、21、27. 因此，離散型污泥中的微生物種類較少決定了其在抗干擾能力和基質利用途徑方面與聚結型污泥存在差異. 兩種污泥內部優勢種群也存在差異，離散型污泥中優勢種群為B and 9、11、12、20、24、25，聚結型污泥優勢種群為B and 7、10、11、17、20、23、25.圖譜中的條帶經克隆測序后將序列信息提交到GenBank數據庫中比對，所有的條帶均在GenBank數據庫中找到了同源性很高的種群. 如表 5所示，大部分菌種為未鑒定或培養的菌種，分布于不同的綱及屬. B and 19、23、25、26、27、31、32屬于變形菌綱(Proteobacteria). B and 1經比對鑒定其序列與硫桿菌屬(Thiobacillus sp.)細菌接近，同源性為100%，該菌可以將廢水中還原態硫化物氧化為硫酸鹽. 與B and 3同源性達99%的Diaphorobacter sp.是一種苯酚降解菌. 數據庫中與B and 4同源性最高的是Uncultured Bacteroidetes bacterium clone CG38，該菌種是在負載不同電極材料的微生物燃料電池當中發現的. B and 21與Sphingopyxis sp.的同源性達到100%，該菌種是從石油污染土壤和石油廢水中篩選得到，經研究鑒定為高效多環芳烴降解菌.上述的3株菌種已經被發現和鑒定為對污染物的去除具有主要作用的菌群，因此，與焦化廢水中污染物的去除有直接的聯系，它們均出現在聚結型污泥的DGGE圖譜中，但在離散型污泥中豐度很低，這與兩種污泥在有機物降解速率上的差異有著密切的聯系.
韶鋼焦化廠酚氰廢水處理站一期工程一級好氧池中大部分易降解有機物和部分可降解的有毒物質得到去除，同時，氰化物、硫氰化物被氧化為氨氮，二級好氧池主要是負責氨氮的硝化，因此，其內部含有豐富的氨氧化菌.氨氧化菌的DGGE圖譜如圖 4b所示，聚結型污泥內部氨氧化菌種群比離散型污泥更為豐富，兩者的Shannon指數分別為0.90和0.60. 將氨氧化細菌的主要條帶進行克隆測序，經條帶克隆測序鑒定得出二級好氧池污泥中氨氧化細菌主要為β-變形亞綱中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，如B and 1、3、4、6、8. B and 5為亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira). B and 2與Uncultured bacterium clone LR A2-14同源性達到97%，該克隆序列是在A2O焦化廢水處理工程好氧池的污泥中發現的.基因數據庫中與B and 3最為相似的序列是Uncultured Nitrosomonas sp. clone R1-1，該克隆序列是在脫氮生物反應器的污泥中提取的，該反應器以喹啉為目標降解物. B and 3、4、6、7為二者所共有，B and 1、2、5、8所代表的微生物菌屬在離散型污泥中豐度很低.活性污泥中氨氧化菌種類越少，對復雜環境的適應能力就越弱，其硝化作用的抗干擾能力也越弱.
4 結論
1)生物流化床處理系統污泥中存在著離散型污泥與聚結型污泥的異質性，前者結構松散、沉降性能較差，后者結構密實，沉降性能較好.造成兩種污泥在性狀和沉降性能上的差異初步認為是由其中EPS含量的高低所造成.聚結型污泥較離散型污泥有更強的基質降解能力，更高的內、外源呼吸比耗氧速率.由此推測出沉降性能好即比重大的聚結型污泥表現出比離散型污泥更高的活性.這種異質性的存在對于提高生物反應器的處理效率具有實質性意義.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。
2)生物流化床處理系統中污泥異質性的存在還表現在內部微生物群落結構在種群豐度上的差異.無論是總細菌還是氨氧化菌，聚結型污泥的群落結構比離散型污泥更為豐富.聚結型污泥總細菌DGGE圖譜中存在3株已經被發現和鑒定為對污染物的去除具有主要作用的菌群，而它們在離散型污泥中豐度很低;聚結型污泥中氨氧化細菌的優勢種群為β-變形亞綱中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira)，而離散型污泥中亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira)豐度很低，未出現在DGGE圖譜中.
