魚粉是水產動物以及畜禽動物養殖飼料中無法替代的優質動物蛋白源[1]。然而，因加工原料新鮮度不斷下降､腐敗等原因，魚粉加工在高溫蒸煮和干燥工序過程中會釋放出大量的惡臭氣體，潘光等[2]已經分析測定出魚粉加工惡臭氣體污染成分主要有兩類，其中含硫氨基酸產生的終產物H2S是魚粉加工惡臭氣體的主要成分。H2S氣體是惡臭成分中最為常見而且影響廣泛的氣體，會引起設備和管道腐蝕，導致嚴重的空氣污染，在空氣中容易被氧化成SO2，可對生態環境產生酸雨效應和毒副作用，H2S氣體還對人體有毒，低濃度中毒對人體眼睛和呼吸系統具有強烈的刺激和腐蝕作用，重度中毒造成中樞神經系統､心臟､肺細胞損害，出現肺水腫，呼吸､心跳驟停，發生閃電型死亡。

　　對于惡臭氣體的治理主要采用遮蔽法､物理化學法､生物法等，遮蔽法沒有完全去除惡臭物質，極易造成二次污染，治理成本也比較高;物理化學法僅能處理成分單一的尾氣，一般設備比復雜，能耗高，處理后仍然不能達到排放標準。生物脫臭技術[3-15]具有脫臭效率高､沒有二次污染､設備簡單､運轉成本較低的優點。目前為止，國內對魚粉加工中有關含硫臭氣脫除微生物篩選與鑒定的研究還未見報道。本研究旨在篩選獲得高效脫除硫化氫惡臭氣體的菌株，為生物法脫除魚粉加工惡臭氣體的應用提供一定的理論基礎。

　　1 材料和方法

　　1.1 分離源

　　寧波市象山某魚粉加工廠的污水沉淀池中的污泥。

　　1.2 主要培養基

　　富集培養基:營養肉湯培養基(篩選細菌):蛋白胨10.0，牛肉浸出粉3.0g，氯化鈉5.0g加熱溶于1000mL蒸餾水中，121℃ 滅菌15min，pH 值7.2~7.4;察氏培養基(篩選真菌):硝酸鈉3.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30.0g加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝115~116℃高壓滅菌30min;自養硫細菌培養基[A][16](篩選自硫菌):Na2HPO4 3.03g，KH2PO42.0g，Na2CO31g，MgCl0.1g，FeCl30.033g，CaCl20.03g，MnCl20.032g，Na2S2O315.7g，蒸餾水1L，其中Na2S2O3 配成溶液過濾除菌，滅菌后加入;自養硫細菌培養基[B][16](篩選自硫菌):Na2S2O35g，K2HPO40.4g，KNO30.4g，NaHCO30.2g，MgSO4 0.12g，NH4Cl0.1g，FeSO4 0.02g，蒸餾水1L，其中Na2S2O3 配成溶液過濾除菌，滅菌后加入。

　　分離培養基:各富集培養基加2%瓊脂。

　　1.3 主要試劑

　　API50CHB試劑條:購自上海梅里埃生物工程有限公司。

　　AxpPrep細菌基因組DNA小量制備試劑盒:Axygen，AP-MN-BT-GDNA-50;DNA 凝膠回收試劑盒;TaqDNA聚合酶;DNAmarker均購自上海桑尼生物工程有限公司。

　　1.4 主要儀器

　　硫化氫分析儀:TY-400-H2S(北京泰亞賽福科技發展有限責任公司);光學顯微鏡:BX51型，(O-lympus公司);掃描電鏡:SU-70型(HITACHI公司)。

　　2 脫硫微生物的篩選

　　2.1 高效除硫菌的篩選

　　2.1.1 脫硫微生物的富集篩選

　　稱取10g活性污泥樣品，分別接種于裝有100mL滅菌后的營養肉湯培養基､察氏液體培養基､自養脫硫細菌培養基A､自養脫硫細菌培養基B的250mL三角瓶中，充分搖勻，30℃，150r/min的條件下搖瓶培養15d，每天往各組培養基中添加Na2S·9H2O(相當于200mg/L的H2S)，以淘汰不能利用S2-的微生物。每3d進行接種傳代，即每次培養3d后，取10mL原培養液接種到新配置滅菌后的100mL各組培養基中。經15d富集培養后，將各組培養液稀釋涂布到對應的平板，30℃倒置培養，平板長出單菌落后挑選典型單菌落反復進行平板劃線，直至得到單一菌落，接種到對應的斜面上，4℃冷藏備用。

　　2.1.2 高效脫硫微生物的篩選

　　初篩:取純化菌株接種于對應類型的培養基中，30℃､150r/min振蕩培養24h。取培養菌液按10%接種量加入到含Na2S·9H2O(相當于200mg/L的H2S)的對應培養基中，搖勻，用雙層保鮮膜封口，30℃靜置培養5d，打開封口，用感官法初步判定菌株除臭效果。

　　復篩:取除臭能力明顯的菌株培養液，按10%接種量加入到含Na2S·9H2O(相當于200mg/L的H2S)對應培養基中，30℃靜置培養5d后，用便攜式H2S檢測儀測定H2S濃度，每組做8個重復，同時設空白對照組。選擇脫硫率最高的目的菌株，接種于對應斜面上，4℃冰箱保存。脫硫率為空白組與實驗組的H2S濃度差除以空白組H2S濃度。

　　2.2 高效除硫菌的鑒定

　　2.2.1 形態學研究

　　參考伯杰氏手冊，采用普通光學顯微鏡､掃描電鏡(SEM)觀察菌株形態特征，并確定菌體大小。

　　2.2.2 生理生化特征分析

　　基礎生化實驗:運動性(半固體穿刺法);硝酸鹽還原;產H2S;VP反應;甲基紅實驗;接觸酶實驗;氧化酶試驗;吲哚反應。

　　碳源的利用實驗:API50CHB 試劑條，API50CHB試劑條是一種用于研究芽孢桿菌的49種糖發酵作用的快速測定試劑條。具體參見http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

　　2.2.3 分子生物學鑒定

　　16SrDNA擴增引物:采用通用引物，27F5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R 5′-CTACG-GCTACCTTGTTACGA-3′。PCR 擴增反應體系(50μL):基因組DNA1.0μL，10×Buffer5.0μL，Taq聚合酶1.0μL，dNTP1.0μL，27F引物1.5μL，1492R引物1.5μL，ddH2O39.0μL。反應參數如下:95℃預變性5min;95℃變性30s;58℃退火30s;72℃延伸90s;72℃終延伸7min;循環數35次。反應完成后，取30μLPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收后進行測序。測序結果與NCBIGenBank中的已知序列進行同源性比較后，判斷菌株種類，將其劃分到屬或種。

詳情請下載：一株魚粉加工硫化氫惡臭氣體脫除菌株的分離與鑒定