污水廠剩余污泥的處置日益成為一個重要的環境問題, 其處置費用約占污水處理廠總費用的60%.受限于填埋場地日趨匱乏及焚燒處理利用價值低的問題, 污泥減量受到了普遍關注.提高污泥脫水性能是污泥減量的重要手段, 其常用的方法有物理法和化學法.物理法通過外加能量或作用力對污泥進行調理, 存在處理成本高的問題;而化學法需要投加大量藥劑因此存在二次污染問題.近年來, 生物法被用于提升污泥脫水性能, 比如生物瀝浸法, 但該方法需要投入大量的微生物營養鹽, 成本較高.因此, 探索新型的生物法來提高污泥脫水性能具有重要意義.
剩余污泥中的胞外聚合物(EPS)對污泥脫水有重要影響, 過多的EPS增加了污泥中結合水的含量從而導致污泥脫水性差.因此, 降低EPS含量成為提升污泥脫水性的一個新方向.某些真菌具有生物轉化活性污泥及降解EPS的能力, 從而能提升污泥的脫水性, 如毛霉屬的Mucor circinelloides ZG- 3及嗜熱真菌中的藍狀菌屬Talaromyces flavus S1.酵母菌具有豐富的胞外酶系, 具有脂肪酶、蛋白酶、氧化酶和過氧化物酶等, 具有潛在降解污泥EPS中蛋白質和多糖的能力, 因此在理論上可以提升污泥的脫水性能.此外, 酵母菌為兼性菌, 更能適應現有的A2/O廢水處理工藝, 事實上酵母菌在實際廢水處理系統中有一定比例的存在(因系統而異).本研究分析了酵母菌對于EPS組分的降解能力, 并探討了通過向活性污泥中接種一定濃度的酵母細胞來提升剩余污泥的脫水性能的可行性.
1 材料與方法
1.1 實驗材料
污泥取自寧波市某采用A2/O工藝污水處理廠的回流污泥.污泥取回后靜置30 min, 倒去上清液并使用孔徑1.2 mm的篩子過篩.靜置后污泥的性質為：污泥沉降比(SV30)為89~91, 混合液懸浮性固體(MLSS)為10.5~13.5 g ·L-1, 揮發性懸浮性固體(MLVSS)為6.0~6.2 g ·L-1, pH值為6.5~7.0, 毛細吸水時間(CST)為20~22 s.
1.2 實驗方法
1.2.1 酵母菌菌株、活化及培養
復合酵母菌群為實驗室篩選并保藏的3株假絲酵母屬菌株, 分別為：Candida tropicalis(O2)、Candida lipolytica(G1)和Candida halophila(W1).將3株酵母菌從斜面分別接種于盛有滅菌(115℃, 20 min)YPD培養液的三角瓶中, 并置于搖床上培養(175 r ·min-1, 28℃)24 h, 之后將3瓶菌懸液等體積混合后接入滅菌的YPD培養液中進行擴大培養.
1.2.2 酵母菌細胞計數及接種量
將擴大培養獲得的酵母菌懸液在8 000 g下離心5 min(Thermo Fisher Multifuge X1R, 美國).酵母細胞用0.9%無菌生理鹽水洗滌、離心3次后, 將濕菌體重懸于生理鹽水中用血球計數法測量酵母細胞濃度, 每次實驗將菌懸液稀釋至2.0×109個·mL-1待用.
1.2.3 活性污泥EPS的提取
將污泥樣品裝入100 mL離心管中, 用超聲破碎儀(上超FS- 600N, 中國)在20 kHz, 480 W下冰浴超聲10 min(經過實驗, 在此條件下超聲強度不足以使細胞膜破裂, 細胞內容物不會流出), 然后分裝至50 mL離心管在12 000 g, 4℃下離心10 min, 上清液即為EPS.
1.2.4 污泥樣品及EPS的顯微鏡觀察
取污泥0.5~1.5 mL于無菌離心管中, 在8 000 g下離心5 min, 然后重懸于2.5%戊二醛溶液中在4℃下放置2 h.倒掉固定液, 用1 mol ·L-1, pH=7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次, 每次的漂洗時間為15 min.對樣品進行乙醇梯度脫水處理, 然后用100%乙醇處理2次, 并于-80℃冷凍干燥(ALPHR1- 2LD, 德國).使用掃描電子顯微鏡(Quanta 250FEG, 美國)觀察樣品.酵母降解EPS實驗中, 取三角瓶中的混合液制成水浸片, 在微分干涉顯微鏡(Nikon 80i, 日本)中直接觀察.
1.2.5 分析方法
污泥脫水性采用毛細吸水時間(CST)來表征, 使用CST測定儀(Triton Electronics 304M, 英國)測定;多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法, 葡萄糖作為標準物質;蛋白質含量的測定采用Bradford法, 牛血清蛋白作為標準物質;核酸含量的測定采用二苯胺比色法, 小牛胸腺DNA作為標準物質.
三維熒光分析(3D-EEM)：用無臭氧氙弧燈作為激發光源, 激發波長Ex的范圍是220~450 nm, 發射波長Em的范圍是260~600 nm.儀器的激發和發射狹縫寬度設定在5 nm, 光柵時間為0.1 s, 掃描速度為3 200 nm ·min-1, 使用Origin 8. 6軟件進行數據處理.
1.3 實驗設計
1.3.1 酵母降解EPS實驗
在6個150 mL的三角瓶中各加入提取的EPS溶液(pH 6.8)100 mL, 在115℃下滅菌20 min.滅菌后置于超凈臺中冷卻至室溫, 向其中3個加入濕菌體0.5 g, 為酵母組;另外3個不添加酵母菌作為對照組, 將三角瓶放置在搖床上175 r ·min-1, 28℃下振蕩.分別在0、24、48和72 h時取混合液測定pH值.為了排除酵母菌細胞對EPS組分分析的影響, 將取出的混合液在12 000 g下離心10 min(Eppendorf Centrifuge 5415R, 德國), 測定上清液中蛋白、多糖、核酸含量;同時使用熒光分光光度計(日立F- 4600, 日本)對活性污泥中的熒光物質組分進行分析.
1.3.2 酵母菌提升污泥的脫水性實驗
在6個直徑為15 cm的有機玻璃反應器中分別裝入混合均勻的2 L污泥, 調節pH為6.8, 向3個罐子中分別加入1.5 g酵母菌濕菌體作為酵母組, 另外3罐不加酵母菌作為對照組.使用電磁振動式空氣泵通過砂芯曝氣頭進行曝氣, 控制溶解氧(DO)為7 mg ·L-1左右, 溫度為28℃.分別于0、24、48和72 h時取污泥樣, 測定pH值和CST.分別提取6個罐子中污泥的EPS, 測定蛋白、多糖和核酸組分含量.取出1 mL提取的EPS稀釋15倍進行熒光物質分析.具體聯系污水寶或參見http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。
2 結果與討論
2.1 酵母菌對EPS不同組分的降解
圖 1反映了72 h內三角瓶中EPS組分含量的變化.從圖 1(a)可以看出, 接種酵母菌的三角瓶中蛋白質含量在24 h內從81.58 mg ·L-1下降到35.73 mg ·L-1, 降解率達到了56.20%;而對照組則從81.68 mg ·L-1下降到63.03 mg ·L-1, 降解率僅為22.83%, 說明酵母菌在最初的24 h對EPS中蛋白組分有較快速的降解作用;相比之下, 24 h之后, 蛋白質的降解速度趨于平緩.從圖 1(b)可以看出, 酵母組中多糖含量在逐步降低, 說明在此過程中酵母菌對多糖有一個持續降解過程, 也表明酵母菌能夠利用多糖作為其生長的碳源.值得一提的是, 對照組的多糖含量在24~48 h沒有下降反而有了略微的上升.為了探究對照組蛋白質和多糖含量變化的原因, 本研究對對照組中EPS溶液進行了顯微鏡觀察, 發現有許多游離細菌存在, 這說明在115℃下滅菌20 min并未能徹底滅活EPS中的細菌, 其原因是EPS可以維持微生物細胞的生物膜穩定性從而對細胞具有保護作用.這些游離細菌有些可以利用(降解)EPS中蛋白質或多糖而生長, 不能利用的細菌因搖瓶EPS中的營養成分缺乏而死亡解體, 從而溶出蛋白、多糖等細胞內容物質.可能因為游離細菌對蛋白和多糖降解能力差異, 造成了降解量和溶出量相對值的不同, 因而出現了蛋白含量降低而后期多糖含量稍有上升的現象. 圖 1(c)為酵母組中核酸含量的變化, 在48 h內核酸從122.50 μg ·L-1大幅度下降至63.33 μg ·L-1, 而對照組中的核酸含量卻有略微地上升, 說明在48 h內酵母菌能顯著降解核酸組分, 但是在48 h后三角瓶中核酸含量有所上升, 可能是長時間振蕩培養導致了營養物質缺乏或者限制, 造成部分酵母細胞死亡釋放出了核酸物質.從圖 1(a)~1(c)中都可以看出酵母菌可以使EPS各組分的含量降低, 但是各組分變化規律不盡相同, 這應該歸因于各組分在污泥EPS中的分布模式不同以及酵母菌對各組分的利用機制的差異.從圖 1(d)可以看出在24 h內, 酵母組的總EPS含量比對照組下降趨勢更為明顯, 表明酵母菌在提高污泥脫水性方面具有一定的潛力. 24~48 h, 酵母組和對照組的總EPS的含量趨于穩定;48 h后酵母組的總EPS有一個下降過程, 而對照組基本趨于穩定.
圖 1 酵母菌對EPS不同組分及總EPS的降解效果
2.2 酵母菌對EPS中熒光組分的降解
為了更進一步探明酵母菌降解EPS中蛋白質的大致分類, 采用3D-EEM方法對酵母菌降解EPS過程中的熒光物質信號變化進行了跟蹤分析. 圖 2中的三維熒光圖譜可定義為Ⅰ和Ⅱ兩種峰.其中, Ⅰ峰的中心位置約為Ex/Em=220~225 nm/330~340 nm, 屬于芳香蛋白區域, 是低激發波長類色氨酸;Ⅱ峰的中心位置約為275~280 nm/305~350 nm, 屬于可溶性微生物副產物區域, 是高激發波長類色氨酸. 圖 2結果顯示, 在24 h內, 對照組EPS的Ⅰ峰熒光強度從3 712下降到3 363, 下降率為9.40%;Ⅱ峰的熒光強度從1 589下降到1 407, 下降率為11.45%;酵母組Ⅰ峰的熒光強度從3 716下降到3 354, 下降率為9.74%, Ⅱ峰的熒光強度從1 529下降到1 294, 下降率為15.37%.由此可以看出, 酵母組的蛋白含量在24 h內比對照組下降更多, 尤其是對Ⅱ峰表示的可溶性微生物副產物有更好地降解效果;因此可以判定, 酵母菌對于活性污泥中的可溶性微生物產物有較好地降解作用, 而這部分物質與污泥的脫水性能關系密切.在24~48 h內, 對照組Ⅰ峰的熒光強度從3 363下降到3 128, Ⅱ峰的熒光強度從1 407下降到1 353, 下降率分別為6.99%和3.84%;酵母組Ⅰ峰的熒光強度從3 354下降到2 844, Ⅱ峰的熒光強度從1 294下降到1 117, 下降率分別為15.21%和13.68%, 可以看出在這段時間內, 酵母菌能繼續降解EPS組分中的蛋白質;在48 h至72 h內, 對照組Ⅰ峰的熒光強度和Ⅱ峰的熒光強度沒有太大的變化, 與化學分析測定的結果相比, 熒光強度下降趨勢一致但下降率偏低, 這是因為熒光分析只能表征一些種類的蛋白, 但化學分析測定測得的是總蛋白含量;酵母組Ⅰ峰的熒光強度有略微上升但幅度很小, Ⅱ峰的熒光強則沒有太大的變化.
(a)~(d)和(e)~(h)分別為對照組和酵母組在0、24、48和72 h的EPS組分熒光
圖 2 酵母菌對EPS中熒光組分的降解效果
2.3 酵母菌降解EPS組分的作用機制
圖 3是向EPS中加入酵母細胞培養后觀察到EPS絮體的微分干涉照片.可以看出, 酵母菌細胞(較大的圓形或者卵圓形細胞)可以與EPS中的膠狀物有效結合, 形成了明顯的絮狀物, 類似于活性污泥的菌膠團結構.有研究表明, EPS可以維持微生物細胞的生物膜穩定性, 是細菌之間相互黏附的重要介質.本研究中絮狀物的形成可能與酵母菌細胞表面性質有關.前期研究中表明, 酵母O2和G1細胞表面具有較強的疏水性, 可以與油脂等疏水性污染物結合, 從而有利于胞外酶對污染物基質的降解以及對代謝產物的吸收. EPS的主要組分是蛋白質和多糖, 其中蛋白質部分具有明顯的疏水性基團, 酵母細胞可能與這些疏水性基團相黏附, 形成絮體并將附著的此類物質降解, 代謝產生的小分子物質可以為酵母細胞提供碳源、氮源等營養.有研究表明, 在不外加營養物質的情況下, EPS可以作為支持某些微生物生命活動的碳源和氮源.本研究中, 酵母菌與EPS膠狀物體結合在一起, 一方面有利于酵母細胞對EPS的降解, 另一方面可以減少游離水中單細胞酵母的數量, 兩者對于提高污泥的脫水性都是有利因素.
圖 3 酵母菌與EPS組分形成的絮狀物質的顯微圖片(10×40)
2.4 酵母菌對提高污泥脫水性的作用
將一定量的酵母菌加入剩余污泥中進行曝氣, 評價了酵母菌對于污泥脫水性的提升作用.提取不同曝氣時間下的污泥的EPS并對其組分進行分析發現, 在24 h內, 投加酵母菌的反應器中, 蛋白質和多糖的含量下降率分別是(76.73±1.66)%和(44.80±3.68)%;而對照組的罐子中蛋白質和多糖含量下降了(67.02±3.09)%和(23.67±0.92)%.相比較可以看出, 酵母菌的添加對于EPS組分中的多糖有明顯的降解作用.有研究表明, 酵母Pseudozyma brasiliensis能通過分泌木聚糖酶從而降解植物多糖;1株土著酵母Saccharomyces cerevisiae依靠PGU1單基因編碼的多聚半乳糖醛酸內切酶來降解可可漿中的果膠類多糖.從圖 4(c)可以看出, 酵母組和對照組的EPS中核酸含量都有所下降, 酵母組比對照組略高;鑒于核酸在總EPS中的占比很低, 因此核酸含量不是影響污泥脫水性的主因.從圖 4(d)中可以看出, 在24 h內, 酵母組中總EPS下降程度比對照組大, 且在24 h時EPS的總量更低, 相應地酵母處理后的污泥CST下降了(17.19±1.16)%, 比對照組多下降了(7.03±1.35)%.但是在24 h之后, 接種酵母的污泥中EPS的多糖和蛋白有略微上升, 這可能與酵母菌自身代謝產物的積累有關, 酵母菌在降解污泥EPS中的多糖后, 經過一定時間培養后自身也會合成多糖排到細胞外.因此, 對于利用添加酵母來提升污泥脫水性能可能存在一個合理的處理時間問題.曝氣時間超過24 h, 酵母組和對照組的CST值都出現了上升, 但是在酵母組中總EPS高于對照組的情況下, 酵母組的CST會更低一些, 可能與酵母細胞參與污泥絮體的構建有關.繼續曝氣至48 h后, 兩組污泥的CST持續上升, 對照組的CST達到23.15 s, 高于采集污泥的原始值;酵母組污泥CST值上升至22.1 s, 與采集污泥的原始值接近.
圖 4 添加酵母并曝氣不同時間后污泥中EPS組分和CST的變化
從圖 4(d)可以看出EPS的含量在一定的范圍內對污泥的脫水性有一定的影響, EPS含量太高會降低污泥脫水性, 有研究報道當活性污泥的微生物胞外聚合物的含量(以ECP/SS計)為35 mg ·g-1(其中ECP為胞外多聚物)時脫水性能最好. EPS在污泥絮狀物結構的穩定性中起重要作用, EPS含量增加, 活性污泥的剪切敏感度降低, 污泥分散度也會降低, 這表明不是EPS含量越低, 污泥脫水性就越好.本研究結果表明, 酵母菌能在24 h內有效降低污泥EPS中的蛋白質和多糖含量, 同時也能降低活性污泥的CST值, 從而有效提高活性污泥的脫水性.從運行的經濟性和效果兩方面來考慮, 24 h應該是酵母提升污泥脫水性的理想處理時間.
2.5 酵母菌對活性污泥中EPS的熒光組分的原位降解
對不同處理時間后酵母組和對照組反應器中污泥的EPS進行三維熒光分析, 譜圖見圖 5.從中可以看出0~24 h, 對照組Ⅰ峰的熒光強度從3 785下降到2 577, Ⅱ峰的熒光強度從1 409下降至1 070, 下降率分別為31.92%和24.06%;酵母組Ⅰ峰的熒光強度從4 655下降到1 958, Ⅱ峰的熒光強度從1 924下降到812, 下降率分別為57.94%和57.80%.從結果可以看出, 相較于對照組, 酵母組污泥中EPS的蛋白含量下降更多, 降解速率更快, 且Ⅱ峰表征的可溶性微生物副產物降解率是對照組的2.4倍;Ⅰ峰表征的芳香族蛋白的降解率是對照組的1.8倍.但在24 h后酵母組對蛋白的降解速率相對下降, 如24~48 h, 對照組Ⅰ峰的熒光強度從2 577下降到1 409, Ⅱ峰的熒光強度從1 070下降到729, 下降率分別為45.32%和31.87%;酵母組Ⅰ峰的熒光強度從1 958下降到1 534, Ⅱ峰的熒光強度從812下降到了695, 下降率分別為21.65%和14.41%.但直到72 h時, 酵母組對Ⅰ峰和Ⅱ峰表征物質的總降解率仍然高于對照組, 分別高出了9.22%和16.43%.
(a)~(d)和(e)~(h)分別為對照組和酵母組在0、24、48和72 h的EPS組分熒光
圖 5 酵母菌對污泥中EPS熒光組分的降解
2.6 酵母菌提升污泥脫水性的機制
從圖 6(a)和6(b)可以清晰地看到酵母菌在活性污泥中的細胞形態特征, 它們處于活性污泥絮體之中, 與污泥的菌膠團結合在一起, 這使得污泥顆粒變大, 更容易沉降和脫水.從圖 6(b)可以看到酵母細胞具有明顯的芽痕, 說明酵母細胞在處理污泥過程中可能有出芽生殖現象, 印證了酵母細胞在系統中具有生物活性, 為連續處理污泥提供了基礎. 圖 6(c)是通過微分干涉顯微鏡對酵母菌在處理活性污泥中的形態進行觀察, 從中也可以明顯看到酵母菌與活性污泥中的膠狀物(EPS)結合在一起, 與在三角瓶實驗中觀察到的結果相吻合.綜上, 酵母菌可以緊密結合污泥中EPS并將其作為營養物質而消耗, 這使得污泥EPS的含量得到了有效地降低, 可以在一定程度上降低剩余污泥的CST值, 從而提升活性污泥的脫水性.從上述實驗結果可以看出, 酵母菌對污泥的原位降解率低于搖瓶實驗, 這是由于實際污泥的生物系統十分復雜, 大量微生物的存在會影響酵母菌的生存繁殖.此外, 環境因素也會影響到酵母菌對污泥EPS的降解.因此, 后續研究需要通過優化相應條件來提高酵母菌對污泥EPS的降解效率, 如pH、碳源、氮源及影響酵母細胞相關酶活性的微量元素等.
(a)和(b)為掃描電鏡; (c)為微分干涉
圖 6 酵母菌在活性污泥絮體中的存在形態
2.6 酵母菌提升污泥脫水性的機制
從圖 6(a)和6(b)可以清晰地看到酵母菌在活性污泥中的細胞形態特征, 它們處于活性污泥絮體之中, 與污泥的菌膠團結合在一起, 這使得污泥顆粒變大, 更容易沉降和脫水.從圖 6(b)可以看到酵母細胞具有明顯的芽痕, 說明酵母細胞在處理污泥過程中可能有出芽生殖現象, 印證了酵母細胞在系統中具有生物活性, 為連續處理污泥提供了基礎. 圖 6(c)是通過微分干涉顯微鏡對酵母菌在處理活性污泥中的形態進行觀察, 從中也可以明顯看到酵母菌與活性污泥中的膠狀物(EPS)結合在一起, 與在三角瓶實驗中觀察到的結果相吻合.綜上, 酵母菌可以緊密結合污泥中EPS并將其作為營養物質而消耗, 這使得污泥EPS的含量得到了有效地降低, 可以在一定程度上降低剩余污泥的CST值, 從而提升活性污泥的脫水性.從上述實驗結果可以看出, 酵母菌對污泥的原位降解率低于搖瓶實驗, 這是由于實際污泥的生物系統十分復雜, 大量微生物的存在會影響酵母菌的生存繁殖.此外, 環境因素也會影響到酵母菌對污泥EPS的降解.因此, 后續研究需要通過優化相應條件來提高酵母菌對污泥EPS的降解效率, 如pH、碳源、氮源及影響酵母細胞相關酶活性的微量元素等.(來源：寧波大學土木與環境工程學院 作者：俞心怡)
