1 引言

　　木質素及其降解物是造紙廢水的重要成分, 占總CODCr的50%左右.由于木質素具有復雜的苯環結構, 因此, 傳統生物處理對其降解耗時長、去除率低.目前, 已經篩選到的降解木質素的細菌大多是好氧細菌, 主要集中在放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)等, 部分能在厭氧情況下生長.純培養功能菌則對菌種培養條件的要求較高、重復性較差, 降解過程非常緩慢.

　　研究表明, 外加直流電場能有效提高微生物強化難降解物質(苯酚、對氯硝基苯、茜素黃R、2, 4-二氯苯酚等)的處理效率, 其影響因素主要包括環境條件(如溫度、pH、氧氣等)、電場作用方式(如電流密度和持續時間)和反應器構型等.不同功能菌適宜的溶解氧條件不同, 較高的溶解氧可以提高好氧微生物活性和促進有機物循環功能菌群的增殖)利用生物電化學系統(BET)處理實際制漿造紙廢水, 結果發現, 在pH=7時, 與厭氧處理(AnT)相比, BET系統的COD(BET/AnT, 55%/51%)、硝酸鹽(33.5%/19.1%)、磷酸鹽(33%/19%)和硫酸鹽(58%/41%)去除率更高.利用電-活性污泥耦合技術處理酸性大紅GR, 結果發現, 在15 mA微電流條件下電-生物技術能克服50 mg·L-1酸性大紅GR對好氧生物處理的抑制作用.目前采用BET系統處理木質素廢水的研究尚鮮見報道.已有研究為Liu等利用活性污泥反應器處理木質素模擬廢水, 結果發現, 木質素去除率低于20%, 并且好氧微生物無法完全降解木質素.因此, 是否可采用電-活性污泥法有效強化木質素降解仍有待研究.

　　直流電場會導致微生物生理特性、細胞膜磷脂組成和群落結構的差異.She等研究發現, 陰極產生的H2可能作為質子供體可提高脫氫酶系統活性, 從而導致NAD/NADH平衡的轉化.Velasco-Alvarez等的研究表明, 低電流(0.42 mA·cm-2, 24 h)能促進Aspergillus niger的分解代謝, 減少生物量的產生, 總ATP含量瞬間升高, 從而導致十六烷的生物降解率提高約15%.Wick等利用PLFA技術研究了暴露于恒定電場(1.4 V·cm-1、1.0 mA·cm-2)中的土壤微生物群落的變化, 結果發現, 外加電場8 d后, 飽和脂肪酸含量受到顯著影響(p < 0.05), 電極附近的樣品與中心土壤樣品相比, 飽和直鏈脂肪酸的含量更高, 這可能是由于電場對流動細胞膜的脅迫作用.目前, 有關電場脅迫條件下微生物群落結構的研究主要集中在極板上附著的生物膜方面, 而在懸浮的活性污泥微生物群落結構的電場影響方面較少涉及.陽極生物膜中Shewanella(Kim et al., 1999)、Geobacter(Bond et al., 2003)、Pseudomonas、Desulfovibrio等菌屬都曾被報道具有很高的電子傳遞能力.Ailijiang等利用生物電化學反應器處理模擬苯酚廢水, 結果發現, 在間歇直流電場運行方式下, 生物膜中Zoogloea和Desulfovibrio等菌屬的相對豐度顯著提高.電極生物膜功能微生物包括能夠進行細胞外電子傳遞的功能菌和其他協作的功能菌.與生物膜法相比, 活性污泥法群落結構具有明顯的差異性, 且活性污泥處于曝氣攪動之中, 特定功能微生物難以富集, 因此, 直流電場對懸浮的活性污泥微生物的影響與電極-生物膜法不同.

　　基于此, 本研究以溶解態木質素模擬廢水為研究對象, 考察活性污泥反應器、電極生物膜反應器及電極生物膜-活性污泥反應器中木質素廢水的處理效能, 探究不同電流強度對懸浮污泥生理特性的影響, 并利用磷脂脂肪酸(PLFA)及16S rRNA基因高通量測序研究不同電流強度下微生物細胞膜磷脂組成和群落結構的差異, 以期為電場強化技術處理木質素廢水的工程應用提供理論依據.

　　2 材料與方法

　　2.1 反應器的啟動與運行

　　實驗包括3個平行運行的SBR反應器, 反應器有效體積為2 L, 其中, R1為常規SBR反應器(對照組, 無電流); R2、R3反應器內設固定在壁上的卡槽以固定電極, 所用電極為一對石墨電極, 有效面積為60 cm2(長20 cm、寬5 cm、厚6 mm), 極板距離7 cm, 兩電極分別與直流穩壓電源的正、負極連接, R2內無接種污泥, R3內含接種污泥.R1、R3接種污泥取自南京某污水處理廠, 污泥濃度控制在3000 mg·L-1.R2每天換水時清理懸浮污泥(污泥濃度 < 30 mg·L-1).為了強化難降解有機物木質素的降解, 加入易降解的葡萄糖為共基質.實驗室配制的模擬廢水的進水COD為530 mg·L-1(COD(木質素磺酸鈉): COD(葡萄糖)=1: 1.2), 由300 mg·L-1的C6H12O6及200 mg·L-1木質素磺酸鈉組成, 此外每升廢水包含117.2 mg NH4Cl、26.9 mg KH2PO4、55 mg MgSO4·7H2O、25 mg CaCl2·2H2O和0.6 mL微量元素混合液.其中, 每升微量元素混合液包含1.5 g FeCl3·6H2O、0.18 g KI、0.12 g ZnSO4·7H2O、0.15 g H3BO3、0.12 g MnCl2·4H2O、0.15 g CoCl2·6H2O、0.03 g CuSO4·5H2O、0.06 g Na2MoO4·2H2O和10 g EDTA-4Na.反應器運行周期為24 h(包括進水0.5 h, 曝氣22 h, 沉淀1 h, 出水0.5 h), 排水比為1/2, 污泥負荷為0.12 kg·kg-1·d-1(以每kg MLSS中的COD(kg)計), 污泥停留時間為10 d, 進水pH為7.6±0.1, 溶解氧控制在3~5 mg·L-1, 溫度維持在(25±2) ℃.

　　2.2 實驗方法

　　R1為不加電流的對照反應器, R2、R3反應器兩電極分別與直流穩壓電源的正、負極連接且以10 mA的弱電流進行馴化, 具體運行方式如下：1~41 d(第1階段), R2、R3外加電流10 mA; 42~53 d(第2階段), 外加電流20 mA; 54~65 d(第3階段), 外加電流30 mA; 66~77 d(第4階段), 外加電流40 mA; 78~89 d(第5階段), 外加電流50 mA; 90~101 d(第6階段), 外加電流60 mA.同時在每個階段對R1、R3反應器中懸浮污泥進行微生物活菌比、三磷酸腺苷(ATP)、比耗氧速率(SOUR)、酶活、PLFA、微生物群落結構等的測定.

　　2.3 分析項目和方法 2.3.1 常規指標測定

　　污泥濃度(MLSS)、COD、NH3-N、TN的測定均參照國標法.微生物活菌比采用LIVE/DEAD© Bacteria Viability Kit (BacLightTM, MolecuLar Probes, Invitrogen L7012)染色法測定, 結果用活菌百分比表示.ATP采用熒光素-熒光素酶法測定.比耗氧速率(SOUR)的測定參照Hao等的方法.

　　2.3.2 木質素磺酸鈉濃度測定

　　紫外分光光度法(UV)是用來測定木質素及其衍生物的常用方法, 木質素及木材提取物中的酚羥基離子在280 nm處存在一個相對穩定的吸收峰.因此, 在制漿造紙行業中該吸收峰通常被用來指示木質素及大部分木材提取物的濃度.通過實驗室分析, 本實驗中所用的木質素磺酸鈉溶液在紫外276 nm(UV276)處存在一個穩定的吸收峰.當木質素濃度低于0.2 g·L-1時, 其濃度與吸光度呈現出明顯的線性關系.

　　2.3.3 木質素過氧化物酶(LiP)測定

　　采用黃丹蓮等報道的方法, 取0.6 mL黎蘆醇溶液(10 mmol·L-1)、1.2 mL酒石酸緩沖液(250 mmol·L-1, pH=3.0)與1.2 mL粗酶液混勻, 在30 ℃下, 于反應液中加入60 μL H2O2溶液(20 mmol·L-1)啟動酶促反應, 并在310 nm波長下測定30 min前后反應液吸光度的變化.一個酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化黎蘆醇產生1 μmol黎蘆醛所需的酶量.

　　2.3.4 細胞膜磷脂脂肪酸分析

　　PLFA的提取方法根據Balser等報道的方法進行了適當修正, 通過對活性污泥樣品的提取、分離及皂化、甲基化、萃取等一系列前處理后, 將提取出的PLFA采用安捷倫7800A氣相色譜進行測定.氣相色譜各參數由MIDI Sherlock程序設置調用.

　　2.3.5 微生物群落結構檢測

　　采用16S rRNA基因高通量測序進行檢測.污泥樣品DNA的提取及PCR擴增采用周莉娜等報道的方法.經瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物后, 采用純化試劑盒(Cycle-Pure Kit, OMEGA Bio-tek, Inc.)純化后送至江蘇中宜金大分析檢測有限公司進行Miseq測序.

　　2.4 數據統計與分析

　　常規水質指標的數據處理采用Origin 9.2軟件, 微生物活菌比結果采用ImageJ軟件進行分析, Miseq數據經Sickle及Mothur降噪后, 通過RDP分類處理.采用SPSS statistics 22.0.0分析軟件進行單因素方差分析(AVONA), 用于檢驗不同物種對于各項環境因素是否具有顯著性差異, 當p < 0.05時, 認為具有顯著性差異.PCA與RDA分析采用Canoco軟件.

　　3 結果與討論 3.1 電流強度對反應器運行效能的影響

　　反應器運行情況如圖 1所示.圖 1a反映了反應器進、出水COD情況, 進水COD為(530.0±7.9) mg·L-1, 第1~41 d(第1階段)時, R1、R3的平均COD去除率分別為73.71%±2.39%和78.88%±1.75%(p < 0.05).第1 d時, R2反應器的COD去除率僅為25.16%, 此時由于反應器中無接種污泥, 因此, COD的去除僅為10 mA電流的作用.第5 d開始, R2反應器的COD去除率升到65.16%, 此時觀察到R2反應器的極板上已有少量微生物附著.第42~53 d(第2階段)與54~65 d(第3階段)時, 電流由20 mA升高到30 mA, 與R1相比, R2、R3的COD去除率分別提高了2%(p < 0.05)和7%(p < 0.05), 出水COD分別為(139.72±5.75)和(112.47±6.06) mg·L-1; 第66 d電流再次升高后, R2與R3的COD去除率開始下降, 最終與R1的COD去除率基本一致.

 　　反應器木質素磺酸鈉進出水濃度如圖 1b所示.1~20 d時, 由于R1、R3中活性污泥對木質素的去除存在污泥吸附作用, 第1 d木質素去除率分別快速地達到44.37%和72.51%. 10 mA條件下R3具有更高的木質素去除率, 可能是由于電場使污泥吸附性能提高.隨著污泥吸附量逐漸達到飽和及微生物的降解, 第20 d木質素去除率分別達到12.59%和23.99%.據報道, 以葡萄糖為碳源, 不同溶解氧的活性污泥工藝啟動初期(1~10 d), COD去除率由75%上升到90% , 由此推測, R1、R3啟動期(1~20 d)共基質葡萄糖與木質素的去除呈相反趨勢.由于R2無接種污泥, 因此, 1~5 d的情況與電解反應器相近, 木質素平均去除率為3.73%±2.66%.靳培培研究了進水苯酚濃度為100 mg·L-1, 電場強度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、7.5 V·cm-1時的電化學反應器(無活性污泥、無電極生物膜)對苯酚的降解率, 結果發現, 降解率分別為2.71%、3.88%、4.84%、7.46%、9.33%、12.79%.可見電化學反應對污染物的降解具有一定的作用, 但降解效率較低.對照組R1的木質素平均去除率(第31~101 d的平均值)為15.02%±0.80%. R3的木質素去除率始終高于R2, 且均隨外加電流的增大呈先升后降趨勢, 在30 mA時木質素去除率均最大.10 mA時, R3穩定后木質素的去除率為26.71%±0.39%, 是R1的1.78倍(p < 0.05);而R2(13.44%±1.32%)低于對照組R1 (p < 0.05).30 mA時, R3、R2反應器的木質素去除率達到最大, 分別為30.19%±0.47%和20.69%±0.54%, 分別為R1的2.01倍(p < 0.05)和1.38倍(p < 0.05).電流增加到40 mA時, 木質素去除率開始下降, 分別為22.81%±1.76%(R3)和14.16%±0.85%(R2); 60 mA時兩個反應器的木質素去除率均低于R1.因此, 一定的外加電流可以提高活性污泥對木質素的去除率, 30 mA為降解木質素的最佳電流取值.

　　圖 1c所示為電流作用對NH3-N去除的影響.R1、R3的NH3-N去除率隨時間變化趨勢一致, 第1~5 d均在68.70%~99.93%范圍內小幅波動, 隨后階段反應器的NH3-N去除率均高于99%, 說明活性污泥存在條件下氨氮快速氧化, 不受電流影響.R2反應器在第1階段NH3-N去除率波動較大, 平均為43.03%±17.32%, 其出水氨氮濃度由第1 d的26.72 mg·L-1快速降低到第5 d的14.66 mg·L-1.這是由于前5 d未采用緩沖溶液控制反應器pH, 反應器水質偏酸(pH≈5), 同時R2極板生物膜量較少, 推測氨氮在陽極上發生電化學氧化反應形成氮氣去除(6·OH+2NH3→N2+6H2O (Marselli et al., 2003)).周明明等報道酸性條件下氨氮的去除率比中性條件高.第5 d后, 調控溶液pH值為中性, 氨氮的去除率下降.隨著第1階段R2電極生物膜掛膜完成, 第41 d, R2反應器(10 mA)的NH3-N去除率達到99%以上, 隨后階段均維持在該水平, 出水氨氮濃度為(0.20±0.13) mg·L-1.龐朝暉等利用短程電極生物膜處理養殖廢水中的高氨氮, 進水氨氮濃度為400 mg·L-1時, 在100 mA以內氨氮的去除率隨電流的增加而明顯提高, 且氨氮去除率均高于90%.

　　圖 1d所示為TN進、出水濃度隨時間的變化.整個過程中, R1與R3的TN去除率變化趨勢基本一致(除第6階段顯著差異), 說明R3的TN去除在50 mA范圍內不受電流影響, 主要由活性污泥脫氮微生物去除.第1~41 d(第1階段)時, R1與R3的出水TN濃度先快速降低到第20 d的9.91和7.01 mg·L-1, 隨后逐步升高到25.50和23.50 mg·L-1(第40 d).第1~20 d的TN去除率上升是由于R1與R3硝化反硝化微生物活性逐步升高, 該階段木質素主要為污泥遞減吸附過程, 而從第20 d開始, 由于降解木質素的微生物活性逐步升高, 推測R1、R3系統中一定濃度的難降解的木質素及其中間代謝產物抑制微生物的脫氮作用, 導致TN去除率降低并在第1階段結束時達到穩定; R2的出水TN濃度在1~40 d與其出水氨氮濃度的變化趨勢相近.由圖 1c中R2在第1階段的氨氮出水濃度可以計算得出, 第1~40 d出水TN濃度中82.58%~97.88%是由氨氮構成, 因此, 推測該階段R2的TN去除率(< 56%)主要是由于氨氮氧化受到限制引起.第2~4階段, R1與R3的出水TN濃度均穩定在14.18~19.58 mg·L-1; 值得注意的是, 此時R2的TN去除率隨電流升高而顯著增強, 為71.96%±5.79%, 出水TN濃度為(8.46±1.73) mg·L-1. R2的電極生物膜反硝化是一個電化學作用和生物反硝化作用相結合的過程, 即部分反硝化菌利用廢水中的有機物或者電解產生的H2為電子供體, 將NO3--N還原為N2.本研究中, 40 mA電流處理后期(75 d之后)及第5階段, 電流升高到50 mA以后, R2的TN去除率逐步降低并穩定在50.77%±1.98%.這可能是高電流下, 反硝化菌的活性受到抑制, 也可能是超過最佳電流后, 陰極產生的氫過多, 在生物膜內形成“氫抑制”現象, 抑制反硝化進行.由于電極生物膜-活性污泥系統中, 影響脫氮的因素復雜, 包括環境條件(pH、溫度、溶解氧)、操作條件(碳源、C/N比、氮負荷、污泥量、運行時間)、電極電化學參數、反應器結構、群落結構等因素, 因此, R2的TN去除率高于R3的原因及機理差異有待進一步探討.

　　綜上, 30 mA電流條件下, 在污泥負荷為0.12 kg·kg-1·d-1時, 電極生物膜-活性污泥反應器(R3)木質素去除率最高, 為活性污泥反應器(R1)的2.01倍(p < 0.05);20~40 mA時電極生物膜反應器(R2)總氮去除率最大, 為71.96%±5.79%.

　　3.2 電流強度對活性污泥微生物活性的影響

　　漆酶、木質素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶(MnP)是最常見的木質素降解酶.目前, 關于細菌降解木質素產MnP的報道非常少.LiP主要來源于真菌, 但最近有研究發現細菌也可分泌LiP.在本研究中, 未檢出漆酶和錳過氧化物酶, 僅測出木質素過氧化物酶.R1、R3反應器的木質素過氧化物酶(LiP)酶活變化情況如圖 2a所示.穩定期R1(0 mA)活性污泥平均LiP酶活為(149.13 ±12.05) U·g-1(以protein計, 下同)(第31~101 d平均值).隨著電流增加, R3活性污泥中的LiP酶活呈先增后降趨勢, 酶活峰值出現在20 mA時.10 mA時, R3活性污泥LiP酶活平均為(175.16±0.01) U·g-1, 略高于對照組R1, 但其木質素去除率為R1的1.69倍; 電流升高到20 mA時, LiP酶活高達(435.82±3.09) U·g-1, 但此時木質素去除率僅提高2%;30 mA時LiP酶活降為(358.07±11.37) U·g-1, 木質素去除率卻升高到最大值30.19%±0.47%;相比于10 mA電流條件下, 40 mA和50 mA時的LiP平均酶活雖較高(p < 0.05), 但其木質素去除率卻較低.由此可見, 木質素去除率受LiP酶活影響較弱.

 　　微生物活菌比可以用來判定活性污泥在受到電流脅迫下細胞膜的損傷程度(圖 2a).R3各電流下的活性污泥活菌比(70.80%±2.67%、73.92%±3.15%、72.80%±2.70%、74.32%±2.28%、70.08%±3.89%、74.95%±0.37%)相比于R1(66.85%±2.12%)有所上升, 統計學分析表明, 不同電流強度下并無顯著性差異(p > 0.05).這表明在10~60 mA的外加電流下, 反應器里面的大部分細菌的細胞膜都很完整, 未出現大量細菌的凋亡.

　　在直流電場的處理過程中, ATP含量可以作為評價微生物代謝活性的生物指標(.R1、R3反應器的ATP含量變化情況如圖 2b所示, 穩定期R1(0 mA)活性污泥ATP含量為(5.74±0.14) μg·g-1(以MLSS計, 下同)(第31~101 d平均值); 10 mA時, R3活性污泥的ATP含量最高, 為(7.81±0.04) μg·g-1; 其次是20 mA與30 mA時, 分別為(5.84±0.01)和(5.58±0.18) μg·g-1; 而40、50、60 mA時ATP含量分別為(3.50±0.19)、(4.02±0.34)和(3.77±0.1) μg·g-1, 顯著低于R1 (p < 0.05).說明30 mA以內不會影響微生物代謝活性, 而過高的電流強度則會抑制微生物代謝活性.Wang等的研究表明, 利用微生物電解池(MEC)處理高硫酸鹽廢水時, 與控制組相比, 0.5 mA時ATP含量增加, 2.5 mA和3.5 mA時, ATP含量急劇下降, 與本研究結論類似.

　　比耗氧速率(SOUR)可作為表征污泥活性的重要指標, 從微生物呼吸速率角度反映活性污泥生理狀態和基質代謝狀況.R1、R3反應器的SOUR變化情況如圖 2b所示, 穩定期R1(0 mA)活性污泥SOUR為(1.26±0.05) mg·g-1·min-1(以每g MLSS每分鐘消耗的O2量(mg)計, 下同) (第31~101 d平均值), 10 mA時, R3活性污泥的SOUR升高, 為(1.38±0.01) mg·g-1·min-1, 20 mA與30 mA時SOUR繼續升高, 分別為(1.75±0.02)和(1.85±0.06) mg·g-1·min-1, 40、50、60 mA時R3活性污泥SOUR降低, 分別為(1.31±0.01)、(1.2±0.03)、(1.33±0.04) mg·g-1·min-1.由此可見, 不同電流下, 活性污泥SOUR變化趨勢與木質素去除率基本一致.

　　綜上, 在懸浮污泥中, 隨著外加電流的增加(0~60 mA), LiP酶活、ATP、SOUR等活性指標均呈先升后降趨勢, 而活菌比則不受影響(p > 0.05).

　　3.3 電流強度對活性污泥微生物細胞膜磷脂脂肪酸的影響

　　不同電流強度下各組樣品的PLFA組成情況如表 1所示, 其中, 在各組樣品中PLFA組成成分含量均低于0.5%的因其含量過低而不具體列出, 磷脂脂肪酸的碳鏈長度主要分布在C11~C20之間, 共檢測到20種類型的磷脂脂肪酸, 其中, 占主要比重的磷脂脂肪酸為C15: 0 ANTEISO、C16: 00和C18: 00.R1(0 mA)活性污泥C15: 0 ANTEISO含量為23.12%.總體而言, 高電流下C15: 0 ANTEISO的含量(16.52%(40 mA)、24.06%(50 mA)、13.86%(60 mA))較低電流下含量低(24.55%(10 mA)、26.77%(20 mA)、25.62%(30 mA)).由于C15: 0 ANTEISO相比于其它支鏈脂肪酸具有較低的相變溫度(23 ℃, 因此, 微生物可以更好地維持其流動性.另外, 60 mA條件下檢測出的磷脂脂肪酸的碳鏈長度變長(C19、C20).Ma等的研究表明, 當反應器達到穩定運行階段時, 長鏈脂肪酸的含量增加(C原子數> 18).

　　表 1 不同電流下活性污泥整體PLFA情況

　　據Fang等報道, 外界環境條件影響微生物細胞膜不飽和脂肪酸的含量.圖 3反映了不同電流下活性污泥微生物細胞膜磷脂的組成情況.如圖 3a所示(其中, SFA、AFA、IFA、UFA、OFA分別代表飽和、反式異構、異構、不飽和和其他脂肪酸), R1活性污泥不飽和脂肪酸的含量為2.22%.高電流(40~60 mA)下不飽和脂肪酸的含量(2.21%~4.17%)較低電流(10~30 mA)下不飽和脂肪酸的含量高(0.37%~1.78%).相反, 低電流(10~30 mA)下支鏈脂肪酸的含量(38.66%~41.53%)高于高電流(40~60 mA)下支鏈脂肪酸的含量(24.56%~39.95%).據報道, 支鏈脂肪酸含量的降低可能是一種防止細胞膜流動過快的防御機制, 從而實現最優生長. Nenninger等的研究表明, 主要長鏈脂肪與主要短鏈脂肪酸的比值增大, 代表著細胞膜磷脂流動性降低.如圖 3b所示, 本研究中, 主要長鏈脂肪酸與主要短鏈脂肪酸分別為C18和C15, 總體而言, 高電流下C18/C15值(0.68~1.45)較低電流(0.66~0.69)高, 因此, 推測高電流下細胞膜磷脂流動性可能降低.

 　　圖 4為不同電流強度下活性污泥PLFA組成主成分分析結果.PC1和PC2分別代表了63.9%和26.9%的差異, 結果主要分布在4個區域.主成分分析顯示, S1、S2、S3與空白之間的差異度較小, 其微生物細胞膜PLFA組成具有一定的相似性, 且以C14~C16支鏈脂肪酸為主; 另外3個區域分別代表了S4、S5、S6樣品, 其與空白組差異度相對較大.S4與其它樣品之間差異度最大, 其PLFA組成以C16和C18飽和脂肪酸為主; S5的PLFA組成以C15飽和脂肪酸與C17支鏈脂肪酸為主; S6的PLFA組成則以C18~C20為主.可見隨著電流的升高, 檢測出的磷脂脂肪酸的碳鏈長度變長.

　　3.4 電流強度對微生物群落結構的影響

　　通過16S rRNA基因高通量測序技術對活性污泥的微生物群落結構進行分析, 結果如圖 5所示.由圖 5可知, R1(0 mA)活性污泥以變形菌門(Proteobacteria, 42.24%)為主, 其次為放線菌門(Actinobacteria, 27.24%).另外, 相對豐度低于10%的門類微生物包括擬桿菌門(Bacteroidetes, 9.22%)、酸桿菌門(Acidobacteria, 3.90%)、TM7(3.78%)、硝化螺菌(Nitrospira, 2.85%)等14個門.高電流下放線菌門的相對豐度(20.74%(40 mA)、21.13%(50 mA)、23.13%(60 mA))低于低電流下的相對豐度(30.25%(10 mA)、39.39%(20 mA)、33.79%(30 mA)), 而變形菌門的相對豐度在高電流下增加(51.93%(40 mA)、51.21%(50 mA)、52.51%(60 mA)).據報道, 能夠降解木質素的好氧細菌種類較多, 目前主要集中在放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)等.本研究的結果表明, 低電流能夠促進放線菌門豐度的增加, 而變形菌門則具有更高的電流耐受力.變形菌門是石油精煉、丙烯酸類高聚物、制藥、乳清粉加工、鋼鐵和寵物食品加工等污水處理廠中的優勢菌門.

 　　陰極和陽極微生物群落結構在門水平上差異較大.R2陰極微生物以變形菌門(Proteobacteria, 84.32%)為主, 除變形菌門占主體外, 其次是放線菌門(Actinobacteria, 11.89%)和擬桿菌門(Bacteroidetes, 2.86%).而陽極微生物則以放線菌門(Actinobacteria, 57.20%)為主, 其次是變形菌門(Proteobacteria, 30.81%)、擬桿菌門(Bacteroidetes, 3.29%)和TM7(1.09%).R3陰極微生物以變形菌門(Proteobacteria, 90.55%)為主, 其次是放線菌門(Actinobacteria, 8.18%).陽極微生物以放線菌門(Actinobacteria, 54.90%)為主, 其次是變形菌門(Proteobacteria, 29.83%)、擬桿菌門(Bacteroidetes, 2.99%)和酸桿菌門(Acidobacteria, 1.20%).可見R2、R3反應器電極微生物在門水平上相似度較高.陰極微生物群落結構均較單一, 且以變形菌門為主, 而陽極則以放線菌門為主.目前, 在微生物燃料電池研究中發現的大部分具有細胞外電子傳遞功能的微生物都屬于變形菌門.已有研究表明, 由于陰極反應將造成電極表層的氧氣濃度降低甚至變成厭氧區, 因此, 會造成電極表面持菌量下降, 這可能是陰極表面微生物群落結構單一的原因.

　　如圖 6所示, 在屬水平上, R1(0 mA)的優勢微生物(相對豐度> 0.20%)包括Micropruina(17.88%, 放線菌門)、TM7_genera_incertae_sedis(3.78%, TM7門)、Nakamurella(2.90%, 放線菌門)、Nitrospira(2.85%, 硝化螺菌)、Microlunatus(1.44%, 放線菌門)、Amaricoccus(1.37%, 變形菌門).總體而言, R3活性污泥在高電流下的Micropruina相對豐度(12.24%(40 mA)、13.23%(50 mA)、12.76%(60 mA))較低電流下的相對豐度低(23.11%(10 mA)、33.76%(20 mA)、27.57%(30 mA)).而高電流下Nakamurella的相對豐度(4.28%(40 mA)、3.35%(50 mA)、4.86%(60 mA))則高于低電流下的相對豐度(2.05%(10 mA)、2.19%(20 mA)、2.77%(30 mA)).已有研究表明, 在以葡萄糖為碳源時, Nakamurella和Micropruina能在細胞內儲存大量的糖類聚合物, 進而成為優勢菌.Amaricoccus相對豐度隨著外加電流的增加大致呈上升趨勢(1.75%(10 mA)、3.09%(20 mA)、3.92%(30 mA)、3.80%(40 mA)、5.45%(50 mA)、6.12%(60 mA)).在適當的電流強度下, Nitrospira相對豐度增加, 20、30 mA時其相對豐度較高, 分別為3.44%和3.47%.Nitrospira屬于亞硝酸氧化菌, 與處理裝置的硝化功能直接有關.Nitrospira相對豐度的增加體現了反應器硝化能力的提高.TM7相對豐度在外加電流下降低, 各電流下其相對豐度均低于1%.在10 mA電流下, Flavobacterium(6.16%)、Pseudomonas(13.89%)和Janthinobacterium(5.93%)相對豐度顯著高于R1(0.17%、0.11%、0.05%).Flavobacterium為革蘭氏陰性菌, 屬擬桿菌門, 是一類能夠降解木質素的非絲狀細菌.該菌屬被認為具有電化學活性, 相關報道較少, 目前用于燃料電池氧化還原酶活性指示菌.Pseudomonas為革蘭氏陰性菌, 屬Gamma變形菌, 據李海濤等的研究, Pseudomonas菌屬可降解低分子量木質素, 曾被報道具有很高的電子傳遞能力, 是目前微生物燃料電池(MFC)中研究最多的功能菌屬之一.Janthinobacterium是一種革蘭氏陰性土壤細菌, 具有不同的能量代謝能力, 耐寒、耐紫外線及其他的環境壓力.

 　　陰極和陽極微生物群落結構在屬水平上差異較大.R2陰極優勢微生物(相對豐度 > 0.20%)包括Methyloversatilis(37.07%, 變形菌門)、Micropruina(9.16%, 放線菌門)、Aquimonas(9.12%, 變形菌門)、Haliscomenobacter(1.16%, 擬桿菌門); 陽極優勢微生物(相對豐度 > 0.20%)包括Micropruina(27.69%, 放線菌門)、Nakamurella(14.42%, 放線菌門)、Pseudomonas(8.24%, 變形菌門)、Thauera(1.99%, 變形菌門)、Mycobacterium(1.73%, 放線菌門)、Ralstonia(1.28%, 變形菌門)、Pseudonocardia(1.12%, 放線菌門)、TM7_genera_incertae_sedis(1.09%, TM7門).R3陰極優勢微生物(相對豐度 > 0.20%)包括Micropruina(5.66%, 放線菌門)、Nakamurella(1.15%, 放線菌門); 陽極優勢微生物(相對豐度 > 0.20%)包括Micropruina(24.32%, 放線菌門)、Nakamurella(19.14%, 放線菌門)、Amaricoccus(4.44%, 變形菌門)、Mycobacterium(3.04%, 放線菌門)、Microlunatus(2.60%, 放線菌門)、Bradyrhizobium(1.41%, 變形菌門).R2、R3反應器陰極微生物在屬水平上差異較大.Methyloversatilis是專性甲基利用型微生物, Zhang等(研究發現, 在混合營養的反硝化生物反應器中, 異養的Methyloversatilis和Thauera菌成為優勢菌屬.R2陰極微生物中Methyloversatilis是優勢菌屬, 這可能是R2反應器第2~4階段脫氮效率高的原因.R2、R3陽極微生物在屬水平上差異較小, 其中, R2反應器中Pseudomonas和Ralstonia菌屬成為優勢菌屬, 且均被報道具有很高的電子傳遞能力.可見與R3相比, R2陽極微生物中存在更多具有電子傳遞能力的菌屬.

　　3.5 微生物群落與PLFA組成和電流強度的相關性分析

　　冗余分析(RDA)被用來研究微生物群落與PLFA組成和電流強度之間的關系(圖 7).RDA1和RDA2分別可以代表 61.5%和32.6%的總差異.電流I與Gemmatimonas、Methylotenera、Gp4、Mycobacterium、Amaricoccus、Nakamurella和Bradyrhizobium顯著正相關(p < 0.05);飽和脂肪酸(SFA)與Zoogloea顯著正相關(p < 0.05);不飽和脂肪酸(UFA)與Mycobacterium、Nakamurella顯著正相關(p < 0.05), 與Micropruina顯著負相關(p < 0.05);反式異構脂肪酸(AFA)與Micropruina顯著正相關(p < 0.05), 與Nakamurella顯著負相關(p < 0.05).這些菌屬隨著電流強度的不同, 其相對豐度均發生了較大的變化.且已有研究表明, Mycobacterium是一類能夠降解木質素的好氧細菌, 而其相對豐度與電流大小顯著正相關(p < 0.05), 可見隨著外加電流的增大, 其相對豐度增加.綜上可以看出, 不同電流馴化出不同的微生物群落, 進而對微生物細胞膜PLFA組成產生了影響, 二者的變化是影響出水水質的重要原因.RDA分析顯示, 各樣品間有較明顯的差異, S1與各樣品間差異均較大, S2與S3樣品間差異較小, S4、S5、S6間差異較小, 空白與S1~S6之間的差異度均較大.

 　　4 結論

　　1) 30 mA電流條件下, 電極生物膜-活性污泥反應器(R3)木質素去除率最高, 為活性污泥反應器(R1)的2.01倍(p < 0.05).

　　2) 外加電流會影響活性污泥微生物的細胞膜磷脂組成, 高電流(40~60 mA)與低電流(10~30 mA)相比, 微生物細胞膜磷脂流動性可能降低.

　　3) 外加電流會改變活性污泥微生物群落結構, R3的懸浮污泥中Flavobacterium、Pseudomonas、Janthinobacterium等可降解木質素的菌屬在外加電流的刺激下, 其相對豐度均有所上升.無接種污泥的R2反應器陽極微生物中存在更多具有電子傳遞能力的菌屬.具體聯系污水寶或參見http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

　　4) Mycobacterium是一類能夠降解木質素的好氧細菌, 其相對豐度與電流大小顯著正相關(p < 0.05), 與不飽和脂肪酸(UFA)顯著負相關(p < 0.05).