由于抗生素的廣泛使用乃至濫用, 環(huán)境中殘留的抗生素對自然環(huán)境中的微生物群落產(chǎn)生了選擇性壓力, 使得抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)在環(huán)境中持久存在并廣泛傳播.目前ARGs已經(jīng)成為了學(xué)術(shù)界的研究熱點, 大量研究表明ARGs廣泛存在于自然水環(huán)境中, 如河流、湖泊乃至海洋.廢水處理系統(tǒng)(wastewater treatment plants, WWTPs)是污染治理體系中的一個重要環(huán)節(jié), 它匯集了人類生活和生產(chǎn)產(chǎn)生的大量生活污水、醫(yī)療污水和工業(yè)廢水等, 被認(rèn)為是自然水環(huán)境中ARGs污染的重要點源, 且促進(jìn)了ARGs的誘導(dǎo)和遷移, 因此, ARGs在不同類型的廢水處理系統(tǒng)中的分布特征得到了廣泛關(guān)注.制藥廢水處理系統(tǒng)(pharmaceutical WWTPs, PWWTPs)的進(jìn)水中往往含有高濃度的抗生素及生產(chǎn)原料和中間體, 對生物處理單元的微生物群落形成高強(qiáng)度選擇性壓力, 為ARGs在污水中的持久存在和傳播擴(kuò)散提供了有利條件, 一些研究證實制藥廢水處理系統(tǒng)的出水中ARGs的濃度高于市政污水處理系統(tǒng)的出水.制藥廢水處理后往往排入下水道, 與其他污水(主要包括未經(jīng)處理的生活污水和經(jīng)過處理的其它工業(yè)廢水)合并后再進(jìn)入綜合性廢水處理系統(tǒng)(integrated WWTPs, IWWTPs), 進(jìn)行統(tǒng)一處理后再排入水環(huán)境中.因此, 為了保護(hù)自然水生態(tài)安全, ARGs在制藥廢水和綜合性兩級廢水處理系統(tǒng)中的分布特征和去除效率應(yīng)給予高度關(guān)注.

　　本研究選取了浙江省某精細(xì)化工園區(qū)內(nèi)一家藥業(yè)集團(tuán)的制藥廢水處理系統(tǒng)和接納該制藥廢水處理系統(tǒng)出水的綜合性廢水處理系統(tǒng), 沿兩級廢水處理工藝流程采集污水和污泥樣品, 以8類共28種ARGs作為目標(biāo)基因進(jìn)行定性檢測, 并對高頻率檢出的7種ARGs和16S rRNA進(jìn)行定量檢測, 分析ARGs在具有上、下游關(guān)系的兩座廢水處理系統(tǒng)中的分布特征和去除效果, 探索ARGs的去除機(jī)制.

　　1 材料與方法1.1 兩級廢水處理系統(tǒng)簡介

　　選取浙江省某精細(xì)化工園區(qū)的兩座廢水處理系統(tǒng)為研究對象, 它們分別是藥業(yè)集團(tuán)的廢水處理系統(tǒng)(PWWTP)和園區(qū)綜合性廢水處理系統(tǒng)(IWWTP).該藥業(yè)集團(tuán)是化學(xué)合成醫(yī)藥原料和獸藥原料的生產(chǎn)商, 主導(dǎo)產(chǎn)品為喹諾酮類抗菌藥、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥等抗生素類藥物, 其中鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素等產(chǎn)品在全球市場上占據(jù)優(yōu)勢地位.該公司產(chǎn)生的廢水是典型的制藥廢水, 有機(jī)污染物濃度高(COD可達(dá)5000 mg ·L-1), 水質(zhì)波動大, 可生化性較差.該公司的廢水處理系統(tǒng)采用A2O工藝, 設(shè)計處理能力為2400 m3 ·d-1, 實際處理水量約為1000 m3 ·d-1.制藥廢水經(jīng)處理后排入園區(qū)下水道, 與園區(qū)其它工業(yè)廢水及周邊生活污水混合(工業(yè)廢水和生活污水的比例約為6 :4), 再進(jìn)入園區(qū)綜合性廢水處理系統(tǒng), 該處理系統(tǒng)主體工藝為氧化溝, 分厭氧段、缺氧段和好氧段運行, 設(shè)計處理能力為22.5萬m3 ·d-1, 目前實際處理水量約為11.5萬m3 ·d-1, 處理后出水排入臨近海域.

　　1.2 樣品采集及預(yù)處理

　　本研究的采樣時間是2015年4月, 兩座廢水處理系統(tǒng)的工藝流程示意圖和采樣點見圖 1, 采樣點具體包括:進(jìn)水(P-Inf和I-Inf)、缺氧池出水(P-Ax和I-Ax)、好氧池出水(P-Ox和I-Ox)和二沉池出水(P-Eff和I-Eff).厭氧池出水由于取樣條件限制未取得.此外, 還采集了二沉池污泥樣品(P-Slu和I-Slu).每個采樣點采集了1 L水樣, 并存放于預(yù)先清洗干凈的無菌聚乙烯塑料瓶中, 冷藏運輸回實驗室后置于4℃保存.污泥樣品存放于無菌的塑料袋中, 冷藏運輸回實驗室后置于-20℃保存.

　　圖 1

圖 1 兩座廢水處理系統(tǒng)工藝流程和采樣點示意

　　1.3 樣品DNA提取

　　水樣中DNA的收集采用0.22 μm混合纖維素酯濾膜(Millipore, 德國)過濾截留方法, 污泥樣品則稱取約0.2 g轉(zhuǎn)移到潔凈的收集管中, 隨后二者均使用PowerSoil DNA Isolation Kit (Mo Bio, 美國)試劑盒進(jìn)行DNA提取.提取完成后, 使用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 (Thermo Fisher, 美國)對DNA濃度和純度進(jìn)行檢測.

　　1.4 普通PCR檢測

　　本研究選擇了8類共27種ARGs進(jìn)行定性檢測, 具體包括7種四環(huán)素類ARGs(tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetQ、tetW), 4種磺胺類ARGs(sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、sul Ⅲ 、sulA), 3種甲氧芐啶ARGs(dfrA 1 、dfrA 12 、dfrA 13 ), 3種β-內(nèi)酰胺類ARGs(ampC、blaSHV、blaPSE- 1 ), 2種大環(huán)內(nèi)酯類ARGs(ermA、ermB), 3種氯霉素類ARGs(cat Ⅰ 、cat Ⅱ 、floR), 2種氨基糖苷類ARGs[aac(3)-Ⅱ a、aac(3)-Ⅳ ]和3種萬古霉素ARGs(vanA、vanB、vanC).所用的引物序列和片段大小見表 1.本實驗所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.普通PCR采用25 μL體系, 包含12.5 μL Premix Ex TaqTM Hot Start Version (TaKaRa, 中國); 各1 μL的上、下游引物; 1 μL的DNA模板; 9.5 μL ddH2O. PCR反應(yīng)程序為: 95℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 共35個循環(huán); 最后于72℃延伸10 min. PCR產(chǎn)物置于4℃保存, 并使用質(zhì)量濃度為1%~2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.

　　表 1 PCR引物序列

　　1.5 實時熒光定量PCR檢測

　　根據(jù)普通PCR定性檢測的結(jié)果, 本研究對tetO、tetQ、tetW、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、dfrA 13 、floR共7種ARGs及16S rRNA進(jìn)行定量測定, 所用引物序列同表 1.采用SYBR Green Ⅰ方法、使用實時熒光定量PCR儀(BioRad CFX96 Touch, 美國)對各目標(biāo)基因進(jìn)行定量測定.定量PCR采用20 μL體系, 包含10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa, 中國), 引物各0.4 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 8.2 μL.反應(yīng)程序為: 95℃預(yù)變性1~2 min; 95℃變性30 s, 退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40個循環(huán).溶解曲線程序為55~95℃, 每0.5℃讀數(shù)一次, 期間停留30 s.測定時, 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以10倍梯度稀釋, 再根據(jù)質(zhì)粒濃度計算得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù), 與通過實時熒光定量PCR測定得到的Ct值對應(yīng)可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線, 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建方法參照張衍等[24]的研究.各目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)在0.988~0.999之間.每個樣品均設(shè)置3個平行樣, 以減少誤差.

　　1.6 數(shù)據(jù)分析

　　使用Excel 2016和Past3.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)方法, P < 0.05(95%置信區(qū)間)被認(rèn)為是顯著相關(guān).

　　2 結(jié)果與討論2.1 兩座廢水處理系統(tǒng)進(jìn)水中ARGs存在情況

　　在27種ARGs中, P-Inf中共檢出了10種ARGs, I-Inf中共檢出了15種ARGs, 結(jié)果如表 2所示.與P-Inf相比, I-Inf中的ARGs種類更為豐富.在檢出的ARGs中, 四環(huán)素類和磺胺類ARGs的檢出較為普遍, 甲氧芐啶類和大環(huán)內(nèi)酯類ARGs有少量檢出, 而β-內(nèi)酰胺類ARGs和萬古霉素類ARGs基本沒有檢出.檢測的7種四環(huán)素類ARGs包含3種抗性機(jī)制為編碼外排泵蛋白的tetA、tetB、tetC基因和4種編碼核糖體保護(hù)蛋白的tetM、tetO、tetQ、tetW基因, 而檢出的基因都屬于后者, 這說明編碼核糖體保護(hù)蛋白的四環(huán)素類ARGs更有可能存在于廢水處理系統(tǒng)中.

　　

表 2 兩座廢水處理系統(tǒng)的進(jìn)水中ARGs檢出情況1)

　　2.2 兩座廢水處理系統(tǒng)中ARGs的分布特征

　　兩座廢水處理系統(tǒng)采集的樣品中目標(biāo)基因的絕對豐度分布情況如圖 2所示.在所有水樣中, 16S rRNA濃度為3.94×107~7.34×108 copies ·mL-1, 高出ARGs濃度0.55~4.58個數(shù)量級; 除P-Ax以外, 其余生物單元水樣中16S rRNA的濃度均高于進(jìn)水和出水, 說明微生物在生物處理單元有效地增殖.在泥樣中, 兩座廢水處理系統(tǒng)的二沉池污泥中16S rRNA濃度均在1011 copies ·g-1水平, 遠(yuǎn)高于水樣中16S rRNA的濃度水平.有報道指出6個PWWTP水樣中16S rRNA主要在105~108 copies ·mL-1的濃度水平, 與本研究結(jié)果一致.另有研究顯示, 在我國杭州、哈爾濱等地的市政污水處理廠的水樣中, 16S rRNA在108~1012 copies ·mL-1的濃度水平, 明顯高于制藥廢水處理系統(tǒng)水樣中的濃度水平.這意味著與市政污水相比, 制藥廢水和工業(yè)廢水對微生物群落產(chǎn)生了更高的選擇性壓力, 因此兩個廢水處理系統(tǒng)中微生物濃度下降.相關(guān)性分析結(jié)果顯示(圖 3), 兩座廢水處理系統(tǒng)水樣中16S rRNA濃度與7種ARGs總濃度顯著正相關(guān)(P < 0.01, r=0.884), 并且與sul Ⅰ (P < 0.05, r=0.818)和sul Ⅱ (P < 0.05, r=0.756)兩種磺胺類抗性基因顯著正相關(guān), 說明廢水水樣中ARGs濃度受到微生物濃度變化的影響.具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.bnynw.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 2

圖中P-Slu和I-Slu樣點單位為copies ·g-1, 余下樣點為copies ·mL-1圖 2 兩座廢水處理系統(tǒng)中ARGs和16S rRNA的分布

　　圖 3

圖 3 廢水處理系統(tǒng)水樣中16S rRNA與總ARGs相關(guān)性

　　有研究指出在PWWTP中, 相比于抗生素濃度, 微生物濃度是影響ARGs的更為重要的因素.在兩座廢水處理系統(tǒng)的進(jìn)水中, ARGs濃度在1.79×103 copies ·mL-1(tetW, P-Inf)~6.14×103 copies ·mL-1(sul Ⅱ , I-Inf)之間, 其中, sul Ⅰ 和sul Ⅱ 基因絕對豐度最高, 隨后依次是dfrA 13 、tetQ、floR、tetO和tetW基因.兩座系統(tǒng)進(jìn)水中ARGs相對豐度的分布順序與絕對豐度一致(圖 4), 仍舊是sul Ⅰ 和sul Ⅱ 基因最高, 隨后依次是dfrA 13 、tetQ、floR、tetO和tetW基因.有研究顯示, sul Ⅰ 和sul Ⅱ 基因以105~107 copies ·mL-1的絕對豐度存在于不同的市政污水處理系統(tǒng)的進(jìn)水中, 濃度水平高于四環(huán)素類ARGs[25, 29, 30], 在制藥廢水處理系統(tǒng)中也有同樣的情況, 這與本研究的結(jié)果一致.四環(huán)素類ARGs中, tetO、tetQ和tetW基因在廢水處理系統(tǒng)中的分布較早地得到了關(guān)注, 在制藥廢水處理系統(tǒng)中也有研究.本研究對這3種四環(huán)素類ARGs的相關(guān)性分析顯示, tetO基因與tetW基因顯著正相關(guān)(P < 0.01, r=0.915), 而tetQ基因與tetO(P=0.27, r=0.442)、tetW(P=0.56, r=0.246)基因正相關(guān)但不顯著, 說明這3種四環(huán)素類ARGs在兩級廢水處理系統(tǒng)中的濃度水平具備相似性, 這可能與它們具備相同的抗性機(jī)制有關(guān).與四環(huán)素類和磺胺類ARGs不同, 甲氧芐啶抗性基因dfrA 13 尚未有文獻(xiàn)報道存在于污水處理系統(tǒng)中.在本研究中, dfrA 13 的絕對豐度水平高于已有研究中檢出頻率較高的3種四環(huán)素類ARGs, 這表明僅著眼于四環(huán)素類和磺胺類ARGs等高頻率被檢出的ARGs類別, 對廢水處理系統(tǒng)中ARGs污染狀況的評估將是不全面的, 未來建議引入高通量qPCR、宏基因組等新技術(shù)進(jìn)行更加細(xì)致全面的研究.

　　圖 4

圖 4 兩座廢水處理系統(tǒng)中ARGs的相對豐度

　　P-Eff匯入I-Inf中, 再由IWWTP進(jìn)行處理. IWWTP需處理多種來源的生活污水和工業(yè)廢水, 不同廢水對I-Inf中ARGs的貢獻(xiàn)不同.每天P-Eff和I-Inf水樣的ARGs總量如表 3所示(ARGs總量估算方法:水樣中ARGs單位體積濃度系統(tǒng)每日處理水量), 可以看到:每天P-Eff對I-Inf中總ARGs的貢獻(xiàn)率為5.05%, 而每天P-Eff的水量僅占I-Inf的0.87%, 說明PWWTP對IWWTP中ARGs污染貢獻(xiàn)較大.更進(jìn)一步地, P-Eff對I-Inf中不同ARGs的貢獻(xiàn)率有較大差異, 貢獻(xiàn)率最高的為sul Ⅰ 基因, 達(dá)9.12%, 其后依次是floR、tetW、sul Ⅱ 、tetO、tetQ, 貢獻(xiàn)率最低的是dfrA 13 基因, 僅為0.17%.通過對水樣中ARGs物質(zhì)流的分析, 可以厘清IWWTP中不同來源廢水的ARGs貢獻(xiàn)率, 為未來有針對性地控制ARGs污染源提供指導(dǎo).

　　表 3 ARGs在兩座廢水處理系統(tǒng)中的傳輸

　　2.3 兩座廢水處理系統(tǒng)對ARGs的作用

　　在兩座廢水處理系統(tǒng)中, 總ARGs濃度在生物處理單元中升高, 經(jīng)過二沉池的處理后, 出水中的總ARGs濃度下降, 其中ARGs濃度在1.27×103 copies ·mL-1(tetW, P-Eff)~3.31×106 copies ·mL-1(sul Ⅰ , P-Eff)之間.而二沉池污泥中, ARGs濃度在1.24×106 copies ·g-1(tetW, I-Slu)~6.19×109 copies ·g-1(sul Ⅱ , I-Slu)之間, ARGs濃度高于出水3~4個數(shù)量級(圖 2), 表明生物處理單元有可能促進(jìn)ARGs的擴(kuò)增和傳播; 大量的ARGs從水中轉(zhuǎn)移到了泥中, 表明二沉池的污泥沉降作用可能是去除污水中ARGs的主要機(jī)制.

　　廢水處理系統(tǒng)對ARGs能否有效去除目前尚有爭議.在中國北方的兩座污水處理廠中, ARGs被證實得到了明顯的擴(kuò)增和傳播, 而在意大利的3座污水處理廠中, 大多數(shù)ARGs能夠被顯著地去除.在本研究中, 兩座廢水處理系統(tǒng)對ARGs的去除同樣表現(xiàn)出了差異(圖 5).總體來看, 經(jīng)PWWTP處理后ARGs濃度上升了0.21個數(shù)量級, 未表現(xiàn)出對ARGs的去除效果, 經(jīng)IWWTP處理后總ARGs濃度下降了1.03個數(shù)量級, 表明PWWTP對ARGs的去除效果相對較弱.進(jìn)一步分析不同基因, PWWTP僅對tetQ、sul Ⅱ 和dfrA 13 基因有去除作用, 分別去除了0.48、0.23和0.79個數(shù)量級; 而IWWTP對除了floR外的基因均表現(xiàn)出了去除效果, 對tetO、tetQ、tetW、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、dfrA 13 以及16S rRNA分別去除了0.92、2.01、1.56、0.83、1.20、0.64及0.98個數(shù)量級. IWWTP對四環(huán)素類ARGs表現(xiàn)出較好的去除效果, 這與浙江省、哈爾濱市、江蘇省多地的市政污水處理廠中的情況類似.在3種四環(huán)素類ARGs中, PWWTP和IWWTP對tetQ的去除效果最好, 這可能與tetQ基因在水環(huán)境中的遷移機(jī)制有關(guān).有研究表明在這3種四環(huán)素類ARGs中, tetQ的遷移率最高, 推測其能夠快速地遷移到活性污泥中, 并隨著污泥沉降作用離開水體而得到去除.相比較之下, 磺胺類ARGs較難被廢水處理系統(tǒng)去除, 推測可能與這兩種基因均位于高效的水平轉(zhuǎn)移元件上有關(guān)[36].經(jīng)PWWTP和IWWTP處理后, 氯霉素類抗性基因floR的濃度分別上升了1.70和0.25個數(shù)量級, 由圖 2可以看出, 相較于進(jìn)水, floR基因濃度在好氧池出水中分別上升了1.12和1.05個數(shù)量級, 顯示其能夠在好氧環(huán)境中廣泛地擴(kuò)增和傳播, 因此, floR基因在廢水處理系統(tǒng)中的分布值得重點關(guān)注.有研究關(guān)注了浙江省四座市政污水處理系統(tǒng)對ARGs的去除情況, 發(fā)現(xiàn)其對tetO、tetQ、tetW基因去除了2.0~3.5個數(shù)量級, 對sul Ⅰ 、sul Ⅱ 去除了1~2.5個數(shù)量級, 去除效果優(yōu)于本研究中的兩座廢水處理系統(tǒng), 這意味著與市政污水處理系統(tǒng)相比, 如何去除制藥廢水處理系統(tǒng)中的ARGs需要更多的關(guān)注.在作者團(tuán)隊后期對該藥業(yè)集團(tuán)廢水處理系統(tǒng)的調(diào)研中, 分別在系統(tǒng)進(jìn)水、水解酸化池出水和好氧池出水中檢出了濃度為5.06、4.88和3.23 mg ·L-1的鹽酸環(huán)丙沙星[37], 表明廢水處理系統(tǒng)中存在高濃度的抗生素, 對微生物群落造成較大的抗生素選擇壓力, 很可能導(dǎo)致系統(tǒng)中出現(xiàn)高豐度的ARGs, 并使得系統(tǒng)中的ARGs較難被去除.

　　圖 5

圖 5 兩座廢水處理系統(tǒng)對ARGs和16S rRNA的去除

　　本研究中的制藥廢水經(jīng)PWWTP和IWWTP兩級處理后, 最終出水(I-Eff)將排入臨近海域, 可能對受納水體的微生物群落產(chǎn)生影響, 引起抗生素抗性的蔓延和傳播, 進(jìn)而對人類健康產(chǎn)生潛在風(fēng)險.此外, 高濃度的ARGs進(jìn)入二沉池污泥中, 可能通過污泥處理和處置過程而在土壤環(huán)境中引起ARGs的蔓延和傳播.廢水處理系統(tǒng)中常見的A2O、氧化溝等工藝是為去除廢水中的常規(guī)污染物而設(shè)計, 對ARGs沒有良好的去除效果在情理之中.為減少經(jīng)廢水處理系統(tǒng)排放至自然環(huán)境的ARGs的總量, 在保證常規(guī)污染物去除效率的基礎(chǔ)上, 強(qiáng)化ARGs的高效去除, 將是未來廢水處理技術(shù)發(fā)展需要應(yīng)對的挑戰(zhàn).

　　3 結(jié)論

　　(1) 在浙江省某精細(xì)化工園區(qū)的兩座廢水處理系統(tǒng)進(jìn)水中, 分別檢出了10種和15種ARGs, 其中高頻率檢出的是四環(huán)素類和磺胺類ARGs; 磺胺類ARGs的絕對豐度最高, 為105~106 copies ·mL-1, 隨后濃度由高到低依次為dfrA 13 、tetQ、floR、tetO和tetW基因; 首次檢出dfrA 13 抗性基因, 且其絕對豐度高于四環(huán)素類ARGs.

　　(2) 兩座廢水處理系統(tǒng)的水樣中16S rRNA濃度低于市政污水處理系統(tǒng)的濃度水平, 并與7種ARGs的總濃度、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 基因濃度顯著正相關(guān).

　　(3) 制藥廢水處理系統(tǒng)出水僅占園區(qū)綜合性廢水處理系統(tǒng)總水量的0.87%, 而總ARGs的貢獻(xiàn)率為5.05%, 傳播輸出最高的3種ARGs為sul Ⅰ 、floR和tetW基因.

　　(4) 制藥廢水處理系統(tǒng)使廢水中總ARGs濃度上升0.21個數(shù)量級, 綜合性廢水處理系統(tǒng)使廢水中總ARGs濃度下降1.03個數(shù)量級; 最終出水直接排海, 可能對近海微生物群落產(chǎn)生影響, 應(yīng)進(jìn)一步評估ARGs通過廢水處理系統(tǒng)進(jìn)入環(huán)境的濃度水平和健康效應(yīng).(來源：環(huán)境科學(xué) 作者：李奧林)