1 引言(Introduction)

　　河流、湖泊等濕地常常成為受納工業污水排放的“匯”.礦山、冶金、電鍍、造紙等生產過程產生大量含重金屬廢水, 是濕地環境的重要威脅(于文金和鄒欣慶, 2007; 李麗鋒等, 2014).因此對濕地重金屬排放進行監測顯得十分重要.目前采用的監測方法如原子吸收法、比色法等, 雖然能夠準確定性和定量, 但是多依賴人工定期或不定期的采集水樣.采樣和檢測過程往往耗時費力、成本較高.不僅如此, 依賴采樣的監測方法不能做到在線連續監測, 容易造成對濕地重金屬污染事件的發現滯后, 從而影響對污染的及時處理.

　　濕地沉積物處于厭氧環境中, 并且含有豐富的有機物, 適合產電細菌生長.許多研究報道了淹水土壤、湖泊、海洋中存在產電細菌.主要分布在變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和酸桿菌門(Acidobacteria)等(Jiang et al., 2016; Kokko et al., 2016).將陽極埋在濕地底泥中, 陰極固定在上覆水中, 可以構成沉積物-微生物燃料電池(Sediment Microbial Fuel Cells, SMFCs).底泥中的產電細菌將分解有機質產生的電子通過胞外電子傳遞交給SMFCs的陽極, 電子通過導線到達陰極, 與上覆水中溶解的O2發生還原反應生成H2O(Deng et al., 2012; 鄧歡等, 2015).流過導線的電流和導線負載兩端的電壓能夠被數據采集裝置在線連續記錄.可以設想, 當含有重金屬離子的廢水進入濕地上覆水后, 會增加水的電導率、降低水體pH, 有利于提高SMFCs電壓或電流.換句話說, 排入到濕地上覆水中的重金屬可能會刺激電壓或電流升高;但另一方面, 上覆水中的重金屬離子如果大量進入底泥, 會抑制產電細菌活性, 從而導致電壓或電流降低(Deng et al., 2015; Jiang et al., 2015).因此, 重金屬廢水進入濕地水體后, SMFCs電信號會做出何種方式的響應, 尚不清楚.

　　已有研究在三電極體系下, 采用交流阻抗法分析陰極和陽極的電荷傳遞電阻(charge transfer resistance)來揭示陰極和陽極電子傳遞的難易程度.通常, 陽極表面形成產電菌膜, 電子能順利地向陽極傳遞, 則陽極的電荷傳遞電阻降低;反之, 當產電菌膜受到破壞, 電子難以向陽極傳遞, 則陽極的電荷傳遞電阻升高(Baranitharan et al., 2015).因此分析陰極和陽極的電荷傳遞電阻有助于揭示重金屬污染物對陰極電子傳遞過程是否具有刺激效應, 以及對陽極電子傳遞過程是否具有抑制效應.另外, 陽極附近沉積物中的產電細菌豐度也是揭示重金屬污染物對陽極影響的重要證據.研究表明水稻土中的產電細菌主要為以下5種類群：地桿菌(Geobacter)、脫硫弧菌(Desulfobulbus)、梭菌(Clostridia)、厭氧粘細菌(Anaeromyxobacter)和希瓦氏菌(Shewanella) (De Schamphelaire et al., 2010; Kouzuma et al., 2013; Lin and Lu, 2015; Cabezas et al., 2015; Sun et al., 2015).筆者在前期工作中, 對本研究采用的水稻土中產電細菌16S rRNA基因進行定量分析, 發現地桿菌科(Geobacteraceae)和梭菌屬(Clostridiium)是優勢的產電細菌類群, 占上述5個細菌類群總量的90%.因此本研究中, 分別采用不同的引物對地桿菌科和梭菌屬16S rRNA基因進行定量, 用以表征土壤產電細菌數量.

　　本研究在實驗室中用淹水水稻土模擬濕地環境, 采用一種新型SMFCs裝置插入水稻土中進行土壤產電, 并在線記錄電壓信號(鄧歡等, 2017).通過向SMFCs裝置陰極附近上覆水中加入CuSO4溶液來模擬重金屬污染事件.研究濕地產電信號對水體中重金屬污染事件的響應特征, 并且通過產電細菌16S rRNA基因定量、SMFCs裝置電荷傳遞電阻分析以及CuSO4溶液理化性質分析揭示電信號響應Cu2+污染的機理.為發展在線原位監測濕地水體重金屬污染的新方法提供理論和實踐依據.

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 土壤采集

　　土壤于2017年10月采集于南京市江寧區水稻田(32°05′18″N;118°59′28″E), 土壤含水量56%, 采樣深度0~20 cm.采樣地為亞熱帶濕潤氣候, 年平均降水量1100 mm, 年平均溫度15 ℃.土壤過2 mm篩并充分混勻.部分樣品自然風干后進行理化性質的測定.土壤總碳(TC)和總氮(TN)通過元素分析儀(Vario EL Ⅲ, Elementar, Germany)測定;土壤pH按土水比1:2.5采用pH計(FE20, Mettler Toledo, Switzerland)測定;土壤電導率(EC)按土水比1:5采用電導率儀(DDSJ-308F, 上海雷磁)測定.土樣的理化性質如下：土壤pH 7.21;TC 31.58 mg·g-1;TN 2.84 mg·g-1;EC 167.15 μS·cm-1.

　　2.2 SMFCs裝置構建和運行

　　本研究采用一種新型SMFCs裝置(圖 1).該裝置陽極為不銹鋼管, 陰極為鉑網, 陽極和陰極分別連接在聚四氟乙烯塑料管兩端.陽極和陰極通過導線與負載串聯, 負載兩端電壓作為監測濕地水污染的信號.該裝置的優勢在于可直接插入濕地底泥中進行原位產電, 產電電壓可進行在線記錄(鄧歡等, 2017).

　　圖 1

　　圖 1本實驗采用的SMFCs裝置示意圖(a)以及SMFCs裝置運行展示(b)

　　向10只2 L玻璃燒杯中分別加入相當于1500 g干重的新鮮水稻土, 之后緩緩地向燒杯中加入去離子水, 保持土壤上覆水深度5 cm以模擬濕地環境.將SMFCs裝置陽極不銹鋼管插入水稻土中, 陰極鉑網位于上覆水水面下方1 cm.陽極和陰極使用鈦絲作為導線與外阻(1000 Ω)串聯.每個燒杯中插入1個SMFCs.外阻與電壓記錄設備(7660B, 中泰研創)并聯, 每隔15 s記錄1次電壓數據.為了模擬野外監測的實際狀況, SMFCs裝置在室溫(14.9 ± 0.4)℃下產電.

　　2.3 CuSO4溶液性質檢測和染毒實驗

　　用無水CuSO4分別配制Cu2+濃度為50、100、200和400 mg·L-1的溶液.對CuSO4溶液的理化性質進行分析：溶液pH采用pH計(FE20, Mettler Toledo, Switzerland)測定;電導率使用電導率儀(DDSJ-308F, 上海雷磁)測定;氧化還原電位采用微電極分析儀(Unisense Microsensor Multimeter Version 2.01)測定.上述測定結果見表 1.分別從上述4個Cu2+濃度的CuSO4溶液中各取5 mL緩慢加入到兩個平行SMFCs裝置陰極上方的上覆水中.同時, 向對照組的兩個平行SMFCs裝置各加5 mL去離子水.連續記錄SMFCs裝置電壓至加銅(對照加水)后180 min.之后抽取陰極附近上覆水采用原子吸收光譜法檢測Cu2+濃度, 同時檢測陰極和陽極的電荷傳遞電阻, 并對陽極附近土壤的產電細菌16S rRNA基因進行定量.

 　　2.4 電荷傳遞電阻

　　陰極和陽極的電荷傳遞電阻采用電化學工作站(VersaSTAT4, Princeton, USA)的交流阻抗法, 以三電極體系進行測定.測定陰極電荷傳遞電阻時, 以陰極作為工作電極, 陽極作為對電極, 同時靠近陰極設置Ag/AgCl參比電極;測定陽極電荷傳遞電阻時, 以陽極作為工作電極, 陰極作為對電極, 同時靠近陽極設置Ag/AgCl參比電極.擾動電壓設為5 mV, 頻率范圍設置10-2到105 Hz.阻抗數據采用ZSimDemo3.30軟件進行分析.

　　2.5 產電細菌16S rRNA基因定量

　　加銅3 h后采集所有處理及平行SMFCs裝置陽極附近土樣, 使用土壤DNA快速提取試劑盒(Fast DNA® SPIN Kit for Soil, MP)按照制造商說明書分別提取土壤DNA.地桿菌科(Geobacteraceae)和梭菌屬(Clostridium)細菌16S rRNA基因豐度采用實時熒光定量PCR法測定, 在CFX96 Real-Time System(BIO-RAD, Laboratories Inc, USA)儀器上運行檢測.這兩個類群細菌的qPCR反應體系都為20 μL, 包括10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq (Takara, Japan), 20 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL, 2 μL模板DNA及7.2 μL ddH2O.引物序列和反應程序見表 2.采用溶解曲線分析擴增產物的特異性, 反應程序為65~ 95 ℃, 每間隔0.5 ℃升溫測定熒光信號.采用10倍稀釋含有標靶基因的重組質粒制作標準曲線.地桿菌科(Geobacteraceae)和梭菌屬(Clostridium)細菌16S rRNA基因標準曲線模板的濃度分別為1.37×109~ 1.37×103 copies·μL-1和2.13×109~ 2.13×103 copies·μL-1.擴增效率分別為90.1%(R2 = 0.991)和102.1%(R2= 0.996).設置3個無模板樣品為陰性對照.

 　　2.6 數據分析

　　土壤產電電壓、陰極和陽極的電荷傳遞電阻、產電細菌16S rRNA基因定量的數據與加入的Cu2+濃度之間關系, 采用origin 8.0軟件進行線性回歸分析.

　　3 結果(Results)3.1 SMFCs裝置產電電壓對Cu2+污染的響應

　　向上覆水加入Cu2+污染之前30 min開始在線連續記錄電壓數據.運行結果顯示, 加入Cu2+污染之前電壓運行十分平穩(圖 2).大多數SMFCs裝置的產電電壓穩定在12 ~ 14 mV附近, 只有對照的1個平行產電在18 mV附近, 以及200 mg·L-1和400 mg·L-1各有1個平行穩定在6 mV附近.向對照加入去離子水之后, 電壓僅出現了微弱的升高, 升高幅度不超過1 mV.這可能是去離子水的加入過程中對陰極附近的環境產生了擾動, 引入了少量O2, 以及促進了陰極表面反應產物的擴散, 這些都有利于提高產電.但本研究在操作過程中盡量做到平緩, 因此沒有引起大的擾動.向上覆水中加入CuSO4溶液之后, 土壤產電電壓立刻升高, 并且在30 s內錄得電壓峰值.隨著加入的Cu2+濃度增加, 電壓峰值呈現升高趨勢, 其中, 加入400 mg·L-1 Cu2+濃度處理的電壓峰值超過了100 mV.所有加銅處理的電壓在峰值之后緩慢降低, 20 min后電壓逐漸平穩.但200和400 mg·L-1 Cu2+處理的電壓穩定后一直高于加入Cu2+污染前的水平.

　　圖 2

　　圖 2加入CuSO4溶液(對照加入去離子水)前后的土壤產電電壓曲線(1和2分別代表兩個平行)

　　3.2 監測Cu2+污染水平的電壓信號選擇

　　由于加入Cu2+污染之前, 不同SMFCs裝置的產電電壓不同, 因此將峰電壓值作為監測Cu2+污染水平的電壓信號是不合適的.例如, 加入Cu2+污染之前, 對照-2的基準電壓為18.3 mV, 而Cu50-1僅為14.5 mV(表 3);加入50 mg·L-1 Cu2+之后Cu50-1的峰電壓為18.9 mV.單從峰電壓判斷, 與對照-2(19.3 mV)接近, 容易被誤認為電壓信號對50 mg·L-1 Cu2+污染沒有響應.為了解決這個問題, 本文采用電壓增量△U作為監測Cu2+污染水平的電壓信號：

 　　其中, 基準電壓為加銅前30 min電壓平均值.電壓增量消除了不同SMFCs裝置基準電壓的差異, 凸顯了電壓信號對Cu2+污染的響應.從表 3可以看出, 電壓增量隨著Cu2+濃度增加呈現不斷上升的趨勢.回歸分析顯示, 加入的Cu2+濃度與電壓增量存在極顯著的線性關系(圖 3).需要注意的是, 本課題組之前的研究表明土壤產電電壓隨著氣溫會產生明顯的波動(Deng et al., 2014).因此基準電壓的時間范圍內應避免有氣溫的變化.本試驗中, 加入Cu2+污染之前30 min內氣溫基本維持在(15.2±0.1) ℃, 保證了基準電壓的穩定.

　　圖 3

　　圖 3電壓增量與加入Cu2+濃度之間的線性回歸曲線

　　3.3 Cu2+污染對SMFCs裝置電荷傳遞電阻的影響

　　分別對陽極和陰極內阻數據進行等效電路擬合.陰極阻抗的等效電路為陰極電荷傳遞電阻(Rctc)和電容元件(C)的并聯電路與歐姆阻抗(RΩ)串聯(圖 4a);陽極阻抗的等效電路為陽極電荷傳遞電阻(Rcta)和電容元件(C)的并聯電路與歐姆阻抗(RΩ)和Warburg阻抗(Zw)串聯(圖 4b).對照組的均高于600 Ω, 而且Rctc隨加入Cu2+濃度的增加而降低, 其中400 mg·L-1 Cu2+處理的Rctc最低, 為400 Ω左右(表 4).回歸分析表明, Rctc與Cu2+濃度呈現顯著的負相關關系(圖 5).與陰極電荷傳遞電阻不同的是, 陽極電荷傳遞電阻Rcta與加入的Cu2+濃度之間沒有顯著的線性關系.但200和400 mg·L-1 Cu2+處理的陽極電荷傳遞電阻與對照相比有明顯的上升.

　　圖 4

　　圖 4陰極(a)和陽極(b)阻抗等效電路圖

 　　圖 5

　　圖 5陰極電荷傳遞電阻與加入的Cu2+濃度之間的線性回歸曲線

　　3.4 Cu2+污染對土壤產電細菌豐度的影響

　　加入Cu2+污染3 h后, 對陽極附近土壤中(以干土重計)的梭菌屬(Clostridium)和地桿菌科(Geobacteraceae)細菌16S rRNA基因進行定量分析, 結果顯示, 不同Cu2+濃度處理下, 梭菌屬16S rRNA基因拷貝數變化范圍3.17×108 ~ 4.62×108 g-1(圖 6).和對照相比, 梭菌屬16S rRNA基因拷貝數未出現隨Cu2+濃度增加而降低的趨勢;地桿菌科16S rRNA基因拷貝數變化范圍4.93×108 ~ 7.37×108 copies·g-1.和對照相比, 加入400 mg·L-1 Cu2+處理的地桿菌科16S rRNA基因拷貝數降低了22%.具體聯系污水寶或參見http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

　　圖 6

　　圖 6地桿菌科(Geobacteraceae)(a)和梭菌屬(Clostridium)(b)細菌16S rRNA基因定量結果

　　4 討論(Discussion)

　　本研究采用一種新型的SMFCs裝置, 對模擬的濕地水體Cu2+污染事件進行原位、在線監測.產電電壓對Cu2+污染的響應迅速, 向陰極附近的上覆水中加入CuSO4溶液后, 電壓立即上升, 達到峰值后回落.本文將加銅后電壓峰值與加銅前基準電壓的差值, 即電壓增量作為監測Cu2+污染的電信號.采用電壓增量作為監測信號的優點在于消除了基準電壓差異的影響.而基準電壓受土壤或底泥理化性質、溫度和產電細菌活性等因素影響(Deng et al., 2014;Jiang et al., 2016).消除基準電壓之后, 電壓增量只與Cu2+濃度相關, 因此采用電壓增量指標有利于提高不同地區、不同季節檢測結果的可比性.

　　Cu2+污染加入陰極附近的上覆水中, 引起了電壓的迅速上升, 而且電壓增量與加入的Cu2+濃度具有顯著的線性關系.推測Cu2+能夠促進陰極反應.為了驗證這一推測, 檢測了CuSO4溶液的一系列化學性質(表 1).結果顯示, 隨著Cu2+濃度的增加, 溶液的電導率和氧化還原電位增加, 溶液pH降低.由于陰極進行以下反應(Wu et al., 2017)：

　　因此, 與陰極表面接觸的Cu2+濃度越高, H+濃度就越大, 越有利于反應向右側進行.另外, CuSO4溶液的加入能夠提高上覆水的電導率, 提高陰極電勢.而且隨著Cu2+濃度的增加, 陰極電荷傳遞電阻有降低的趨勢, 表明Cu2+促進陰極反應的進行.這些因素都有利于增加SMFCs裝置的電流, 從而提高1000 Ω負載兩端的電壓.而電壓達到峰值之后回落, 這可能是由于陰極附近Cu2+的擴散以及被淹水土壤大量吸附有關(Deng et al., 2009).本研究在CuSO4溶液加入3 h后檢測陰極附近上覆水的Cu2+濃度, 發現400 mg·L-1 Cu2+處理中Cu2+濃度最高僅為0.81 mg·L-1.隨著陰極附近Cu2+濃度的減少, 銅對陰極反應的刺激效應隨之減弱, 導致電壓在達到峰值之后逐漸降低.

　　本研究的結果顯示, 高濃度Cu2+污染對底泥產電細菌產生了不利的影響.基因定量結果顯示, 400 mg·L-1 Cu2+處理的地桿菌科16S rRNA基因拷貝數比對照降低了22%, 但高濃度Cu2+污染未對梭菌屬16S rRNA基因拷貝數產生明顯的抑制.在之前的研究中, 我們對從土壤中分離的一株梭菌屬產電細菌進行抗銅能力測試, 發現在10 mg·L-1 Cu2+濃度下其產電能力仍然沒有顯著降低(Deng et al., 2017).梭菌屬的細菌為革蘭氏陽性, 抗銅能力可能與細胞壁對Cu2+的吸附有關.另外, 阻抗檢測也顯示, 200和400 mg·L-1 Cu2+處理的陽極電荷傳遞電阻也比對照有明顯上升.電荷傳遞電阻升高表明電極反應速度變慢, 對于陽極而言, 表明產電細菌的活性降低(Islam et al., 2017).

　　在以往的研究中, 我們分別采用了重金屬(Cu2+、Cd2+)和有機污染物(芘)與土壤混合, 并將陽極埋設在污染土壤中進行產電(姜允斌等, 2014;Deng et al., 2015;Jiang et al., 2015).由于污染物直接抑制陽極表面土壤產電細菌活性, 從而造成土壤產電電壓降低.本研究中污染物是加入到上覆水而非土壤中, 產電信號主要反映的是陰極對Cu2+的響應, 而且陽極附近產電細菌受到底泥的保護, 不易受到水體重金屬污染的影響.因此產電電壓在污染后迅速上升而不是降低, 并且從峰值回落并達到穩定之后, 電壓仍然高于加銅前的水平, 這些都表明Cu2+污染對于陰極反應的刺激作用是主要的, 對陽極產電細菌的抑制作用是次要的.也正因為監測濕地水污染時, 底泥中的產電細菌不易受到重金屬抑制, 從而完成對一次污染事件的監測之后, 電壓能夠重新回到穩定狀態, 以便進行下一次監測, 所以本研究結果有助于實現對濕地水體重金屬污染進行長期的原位在線監測.

　　5 結論(Conclusions)

　　1) 本研究采用的新型沉積物-微生物燃料電池裝置能夠插入濕地底泥, 產生穩定的電壓信號.當水體發生Cu2+污染事件時, 電壓迅速升高, 且電壓增量與加入的Cu2+濃度存在顯著的正相關關系.

　　2) Cu2+污染對陰極反應具有促進作用, 是引起電壓升高的主要原因.而產電細菌受到底泥的保護不易受到水體重金屬污染的影響, 保證了產電信號在Cu2+污染事件結束后仍然穩定運行, 從而該裝置可長期原位在線監測濕地水體Cu2+污染.(來源：環境科學學報 作者：吳少松)