煤化工企業排放的廢水中含有大量的酚、氰油、氨氮、多環芳香族化合物及含氮氧硫的雜環化合物等有毒有害物質，綜合廢水中CODCr一般在2000～5000mg·L-1，氨氮在200～500mg·L-1，是典型的含有難降解有機化合物的工業廢水。據煤化工行業調查分析，約70%的機焦廢水未經過脫氮處理直接外排，30%的機焦廢水未經任何處理直接外排。廢水的超標排放對水產、農作物甚至人類健康都構成了極大危害，因此，尋找高效的污水處理方法是當前急待解決的課題。目前，國內外處理煤化工廢水的方法主要有物理法、化學法和生物法。生物法主要通過微生物的新陳代謝作用，將廢物吸收、分解，達到治理污染的目的，因其具有經濟、綠色、安全、有效的特點，得到了廣泛應用。污水中常含有多種性質不同的物質，用單一菌種很難將其徹底降解，在生產中主要以活性污泥法和高效菌劑相結合來處理這一問題。當前，越來越多的國內外學者在污水生物處理過程中引入PCR-DGGE方法，用以研究微生物群落的復雜性，監測種群動態，依據污水處理過程中的群落動態變化，調節實際工藝參數，提高污水處理效率。本研究主要對煤化工廢水中篩選出的高效COD降解菌進行生物強化，對菌株進行高效配比研究，制成生物菌劑，研究其在污水處理過程中微生物群落結構的動態變化及降解特性，以期為提高煤化工廢水處理系統的效率提供科學依據。

　　材料

　　樣品來源

　　樣品主要采自中國神華煤制油化工有限公司包頭煤化工分公司(污水1)、康達東營環保水務有限公司(污水2)、中海油天津化工研究設計院(污水3)。采回的樣品置于4℃保存。

　　培養基

　　分離培養基(固體)。牛肉膏1.5g，蛋白胨2.5g，KH2PO40.725g，Na2HPO41.136g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.02g，NaHCO385mg，2%瓊脂，微量元素Ⅰ，微量元素Ⅱ，蒸餾水1000mL，pH值7.0～8.0。其中，微量元素Ⅰ:FeSO45mg，EDTA5mg;微量元素Ⅱ:EDTA15mg，ZnSO4·7H2O4.3mg，CoCl2·6H2O2.4mg，MnCl26.29mg，CuSO4·5H2O2.5mg，Na2MoO4·2H2O2.2mg，NiCl2·6H2O1.9mg，H3BO30.14mg。將上述配置好的培養基置于0.11MPa，121℃條件下滅菌20min。富集培養基(液體)。C6H12O61.2g，其他成分同分離培養基。培養基配好后置于0.11MPa，115℃條件下滅菌25min。

　　復篩培養基。配制模擬污水，COD濃度分別為2560，3040，5280mg·L-1，pH值7.0～8.0(用5%Na2CO3和HCl調pH值)。配好的培養基于0.11MPa，115℃條件下滅菌25min。

　　COD試劑

　　Ag2SO4，HgSO4，K2Cr2O7，C6H4(COOH)(COOK)，均為分析純，均購自天津市化學試劑研究所。

　　DGGE試劑

　　DuRed核酸染料，40%C3H5NO/Bis(37.5∶1)，50×TAEBuffer，0%變性液(10%Gel)，80%變性液(10%Gel)，10%(NH4)2S2O8，1μL·mL-1TEMED。

　　煤化工廢水COD降解菌篩選

　　煤化工廢水取樣后富集培養，采用稀釋涂布平板法、平板劃線分離法篩選分離COD降解菌。分離純化菌株，4℃斜面保藏。按5%接種量接種至裝有100mL滅菌模擬污水培養基的250mL錐形瓶中，30℃，150r·min-1振蕩培養，48h后更換培養基并逐步提高模擬污水COD濃度，測定降解后模擬廢水COD濃度，計算菌株降解率。

　　OD降解率測定

　　采用快速消解分光光度法對化學需氧量進行測定。取待測菌懸液樣品10mL，7000r·min-1離心10min，上清液稀釋至COD量程范圍內，加入到裝有消解液的消解管中，放入HACH消解儀消解，波長600nm測吸光度，超純水作參照，做標準曲線，計算COD降解率。

　　ρ(COD)=n[k(As-Ab)+a]。(1)

　　式(1)中，ρ(COD)為水樣COD值，n為水樣稀釋倍數，k為鄰苯二甲酸氫鉀COD校準曲線靈敏度，As為試樣測定的吸光度，Ab為空白試驗測定吸光度，a為校準曲線截距。

　　M/%=100×(x0-x)/x0。(2)

　　式(2)中，M為COD降解率，x為反應后COD濃度，x0為初始COD濃度。

　　生物菌劑的復配研究

　　將篩選出的5株高效菌株搖瓶培養，采用不同方式進行組合，測各組合COD降解率，得最優復配組合，配制成菌劑進行生物強化研究。具體聯系污水寶或參見http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

　　生物菌劑的生物強化

　　取3種煤化工污水進水水樣和氧化段活性污泥。在最優降解條件下，將生物菌劑分別接種3種污水培養基，并對高效降解菌的降解特性進行研究。處理1到處理3，分別向污水1到污水3中加入菌劑;處理4到處理6，分別向污水1到污水3中加入菌劑及活性污泥;處理7到處理9，分別向污水1到污水3中加入活性污泥。

　　每組樣品廢水體積150mL，接菌量統一按照10%設置，投加污泥量統一為75mL。試驗所加活性污泥系生物菌劑強化，出水鏡檢，微生物量較少時，污泥強化完成。每組試驗平行2次。各處理均于30℃，150r·min-1條件下振蕩培養，每隔24h測定各處理COD降解率。

　　PCR

　　采用OMEGA-SoilDNAKit試劑盒提取污泥DNA，采用LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR試劑盒提取菌株DNA。PCR擴增采用TouchDownPCR模式運行。先對16SrDNA全長序列進行擴增，引物是27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-TACCTTGTTACGACTT-3');然后再對16SrDNA的V3可變區進行擴增，引物是338f-GC(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和518r(5'-ATACCGCGGCTGCTGG-3')。PCR反應體系(50μL):10×PCRBuffer(Mg2+)5μL，dNTPmixture(各2.5mmol·L-1)4.0μL，引物各1μL(10pmol·μL-1)，模板DNA2.5ng，TaKaRaTaq酶(5U·μL-1)0.25μL，滅菌蒸餾水定容至50μL。PCR反應程序:94℃預變性5min;94℃變性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，每個循環退火溫度降低0.1℃，終至51.5℃，35個循環;72℃最終延伸10min，4℃保存。取2μLPCR反應產物，0.8%瓊脂糖凝膠電泳。對菌落16SrDNA的PCR產物進行純化測序，步確定所分離細菌的分類學地位。

　　DGGE

　　采用Bio-Rad公司UniversalMutation檢測系統對神華廢水的PCR擴增產物進行電泳分離。具體步驟:制備垂直膠，確定分離含有核苷酸改變的DNA片段的最佳梯度范圍;制備水平膠，用梯度混合器制備變性劑濃度不同的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從膠的上方向下方依次遞增，待膠凝固后，將膠板放入裝有電泳緩沖液的裝置中。經前期條件優化，確定DGGE操作條件:樣品/上樣緩沖液為6∶1，上樣15μL，電壓60V，60℃條件下電泳15.5h;DuRed凝膠染色，搖床振蕩30min，超純水沖洗脫色;最后用QuantityOne4.6.2軟件分析DGGE圖譜，得各樣品間相似性矩陣圖，研究微生物多樣性、豐富度、條帶強度分布情況和不同處理階段樣品中微生物相似性等。選擇條帶強度較大的優勢菌帶，切膠回收，PCR擴增細菌16SrDNA的V3區，DGGE分析是否為單一菌。

　　本研究篩選得到5株COD高效降解菌，將菌株經復配、污泥強化，得到強化菌劑，對3種煤化工廢水COD的去除率均達89.3%以上，抗沖擊負荷能力顯著增強，菌劑在投加污水后經過適應期后一直占據優勢地位，且對高濃度COD污水的處理效果也很理想，表明該菌劑具有發展成為商品菌劑的潛力。開發該商品菌劑有利于節約污水處理成本，對污水處理系統的快速啟動也具有積極意義。