1 引言(Introduction)

　　直接染料是一類能夠直接讓纖維及其他物質著色的染料，也是最為常見的染料種類之一。但在直接染料使用過程中約有10%的染料被排放到水中，造成嚴重的水環境污染。另外，由于直接染料具有較強的親水性，導致直接染料廢水很難達到較好的處理效果，因此，研究直接染料廢水處理技術對于未來直接染料的持續應用具有重要的意義.

　　目前，針對染料廢水的處置方法主要包括物理、化學和生物法。其中，物理和化學法雖然具有較好的脫色效果，但存在COD去除率低、成本高、產生二次污染等特點，嚴重阻礙了染料廢水處理技術的推廣和應用。而生物法處理染料廢水具有持續性降解、環境友好且對環境產生的二次污染更小等特點。目前在染料廢水治理方面應用較多的微生物主要包括細菌、白腐真菌、放線菌和藻類等.其中，白腐真菌憑借其廣譜、高效、低耗、適用性強的生物降解能力，對多種結構的染料具有明顯的脫色能力。自20世紀80年代初，Glenn和Gold首次發現黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)可以對部分聚合染料脫色降解以來，人們陸續開展了P. chrysosporium對偶氮、蒽醌、三苯甲烷等不同類型染料降解的研究。近年來，具有脫色能力的白腐真菌被不斷挖掘，如彩絨革蓋菌(Coriolus versicolor)、變色栓菌(Trametes versicolr)、靈芝(Ganoderma sp.)、粗皮側耳(Pleurotus ostreatus)、一色齒毛菌(Cerrena unicolor)等。目前，人們對白腐真菌降解染料的研究已經深入到分子水平，對其降解機理有了一定的了解.但由于白腐真菌發揮降解功能受碳源、氮源、pH、金屬離子、鹽度、溫度等因素的影響，因此，白腐真菌在染料廢水治理方面的工業化應用仍存在著諸多問題需要解決.

　　因此，本研究以直接大紅染料為研究對象，在進行菌株CB1鑒定的基礎上，采用單因素及正交試驗探究菌株CB1脫色直接大紅染料的優化條件，以期為菌株CB1在直接染料廢水治理方面的應用奠定基礎.

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 材料2.1.1 供試菌株

　　菌株CB1由本實驗室人員分離于野外朽木上，菌絲體保存于貴州大學林學院森林保護學科實驗室.

　　2.1.2 染料

　　直接黑CT、直接金黃2GT、直接大紅4BS、直接嫩黃5GL、直接蘭B2RL等染料及其他化學試劑均購自上海生物工程技術有限公司.

　　2.1.3 培養基

　　PDA培養基：稱取去皮新鮮馬鈴薯200 g，加入適量水煮沸20 min后，用4層紗布過濾，取濾液依次加入葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然;PDB培養基：PDA培養基制作過程中不加入瓊脂粉所得液體發酵液;染料發酵液：PDB培養基制作過程中向培養基中加入直接大紅染料，使染料終濃度為50 mg·L-1.

　　2.1.4 試劑盒

　　DNAquick快捷型植物基因組非離心柱型試劑盒(TIANGEN).

　　2.2 方法2.2.1 菌株CB1的鑒定

　　挑取PDA斜面菌株CB1的菌絲接種于PDA平皿中央，28 ℃下暗培養7 d，分別于接種后的第1、3、5、7 d觀察菌絲生長狀況及顏色變化等.同時于第7 d，挑取培養皿中尖端菌絲進行顯微結構的觀察，完成菌株的形態學鑒定;刮取5皿新活化的菌株CB1菌絲，利用DNAquick快捷型植物基因組非離心柱型試劑盒(TIANGEN)提取菌株CB1的基因組DNA.以基因組DNA為模板，利用ITS1和ITS4真菌通用引物擴增菌株CB1的ITS序列.PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后送上海生物工程有限公司測序，序列校正無誤后，提交至NCBI的Genbank，并將該序列與Blast比對結果中的序列進行比對分析.同時選取一株偏腫栓菌(Trametes gibbosa)的ITS序列作為外源基因，利用Clust2.0進行序列比對分析，利用MEGA5.0軟件的Neighbor-joining法構建系統發育樹.

　　2.2.2 菌株CB1對5種直接染料的脫色

　　在PDA培養基制作的過程中，向培養基中分別加入直接黑CT、直接金黃2GT、直接大紅4BS、直接嫩黃5GL、直接蘭B2RL染料，使染料終濃度為50 mg·L-1.培養基經121 ℃高溫高壓滅菌后，無菌條件下制作PDA平皿.截取直徑8 mm新活化菌株CB1的菌絲塊于平皿中央，28 ℃下暗培養10 d后，觀察平皿脫色情況，以不接入菌絲、含相同濃度染料的PDA平皿作為對照.

　　2.2.3 菌株CB1對直接大紅染料脫色的單因素優化

　　碳源和氮源種類對菌株CB1脫色直接大紅的影響：在染料發酵液制作過程中分別以20 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為碳源，分別向染料發酵液中加入1 g·L-1的硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、尿素、蛋白胨作為氮源，分別取上述40 mL發酵液加入到100 mL三角瓶中，121 ℃高溫高壓滅菌后，分別向三角瓶中轉入直徑8 mm新活化的菌株CB1菌絲塊3片，于28 ℃暗培養9 d;以染料發酵液中接入直徑8 mm新活化的菌株CB1菌絲塊3片作為對照，分別在第1~9 d測量吸光值，計算對應處理的染料脫色率.

　　pH對菌株CB1脫色直接大紅的影響：在100 mL三角瓶中加入染料發酵液，分別調整液體培養基的pH為3、5、7、9、11，經121 ℃滅菌后，向三角瓶中接入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片，于28 ℃暗培養9 d，以pH自然，含有等量染料的發酵液作為對照，分別在第1~9 d測量吸光值，計算對應處理的染料脫色率.

　　金屬離子對菌株CB1脫色直接大紅的影響：在100 mL三角瓶中加入40 mL染料發酵液，分別向三角瓶中加入1 mmol·L-1的CuSO4、MnSO4、CaCl2、MgSO4、ZnSO4、FeCl3，經121 ℃滅菌后，向三角瓶中接入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片，于28 ℃暗培養9 d;以染料發酵液接入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片作為對照，分別在第1~9 d測量吸光值，計算對應的染料脫色率.

　　2.2.4 正交試驗優化菌株CB1對直接大紅的脫色

　　在單因素試驗得出的較優pH條件下，選擇較優碳源(A)、氮源(B)、金屬1離子濃度(C)和金屬2離子濃度(D)設計四因素三水平L9(34)的正交試驗，正交試驗因素和水平見表 1.在100 mL三角瓶中加入40 mL染料發酵液，按L9(34)的正交表調整培養基中碳源濃度、氮源濃度和2種金屬離子濃度進行9個不同處理的脫色試驗，發酵液經121 ℃高溫高壓滅菌后，向三角瓶中加入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片，于28 ℃暗培養9 d，分別在第1~9 d測量吸光值，計算對應處理的染料脫色率.

　　表 1 正交試驗優化菌株CB1脫色直接大紅染料的因素水平

　　2.2.5 正交試驗的驗證

　　在正交試驗的基礎上，按正交試驗最優條件配置含有50 mg·L-1直接大紅染料的PDB液體培養基，121 ℃高溫高壓滅菌后，向三角瓶中加入直徑8 mm新活化的菌絲塊3片，于28 ℃暗培養9 d，分別在第1~7 d測量吸光值，計算對應的染料脫色率.

　　2.2.6 染料吸光值的測定及脫色率的計算

　　在菌株CB1液體發酵的過程中，分別于培養第1、2、3、4、5、6、7、8、9 d吸取1.2 mL發酵液，10000 r·min-1離心5 min，吸取上層發酵液1 mL，于直接大紅4BS染料最大吸收波長λmax=495 nm下測定染料吸光值，以相同處理條件下不接菌的染料發酵液作為對照.測得對照吸光值為L0，不同時間處理吸光值為Lt，則染料脫色率R=(L0-Lt)/L0×100%.

　　3 結果與分析(Results and analysis)3.1 菌株CB1的鑒定

　　菌株CB1生長很快，28 ℃下暗培養7 d后可鋪滿平皿(直徑9 cm)，培養基無明顯顏色變化;菌絲緊貼于瓊脂培養基表面生長，成絨毛狀白色菌落，表面平滑;平皿邊緣菌絲為升起的羊毛狀(圖 1a)，這與由慶和何艷喜對變色栓菌(Trametes versicolor)的形態學鑒定結果相類似(何艷喜，2010; 由慶，2016).菌株CB1的ITS序列擴增得到一長度為643 bp的序列，該序列提交至NCBI數據庫獲得的Genbank號為KY949632.菌株CB1 ITS序列Blast比對的前100條結果中，該序列與Genbank號為AB811868.1和KJ528276.1的T. versicolor的ITS序列相似性高達100%，與Genbank號為AB811857.1、KC176306.1、FJ810146.1等70余株T. versicolor不同菌株的ITS序列相似性達99%.選取菌株CB1的ITS序列及其Blast比對結果中部分序列及一株T. gibbosa ITS序列共同構建的系統進化樹見圖 2.由圖可知，菌株CB1與不同菌株來源的T. versicolor的ITS序列構成一個分支，分支內親緣關系較近，而T. gibbosa的ITS序列單獨作為一個分支，與菌株CB1及T. versicolor的ITS親緣關系較遠.因此，結合形態學與分子生物學的鑒定結果，將菌株CB1鑒定為變色栓菌，命名為Trametes versicolor CB1.

　　圖 1菌株CB1形態學鑒定(a.菌株CB1菌落正面;b.菌株CB1菌落反面;c.菌株CB1菌絲顯微結構，箭頭指向為索狀聯合)

　　圖 2菌株CB1 ITS序列的系統發育樹

　　3.2 T. versicolor CB1對5種直接染料的脫色

　　固體條件下，T. versicolor CB1對5種直接染料脫色10 d后的結果見圖 3.由圖可知，T. versicolor CB1對直接黑CT、直接金黃2GT、直接大紅4BS、直接嫩黃5GL、直接蘭B2RL 5種直接染料均有脫色能力.肉眼觀察平皿顏色變化可發現，T. versicolor CB1對直接大紅染料的脫色效果相對更明顯，故在接下來的試驗中以直接大紅染料為研究對象，進行T. versicolor CB1對直接大紅染料脫色條件的優化.

　　圖 3菌株CB1對5種直接染料的固體脫色

　　3.3 碳源和氮源種類對T. versicolor CB1脫色直接大紅的影響

　　不同碳源、氮源條件下，T. versicolor CB1對直接大紅染料的脫色結果見圖 4.由圖 4a可知，與不添加碳源相比，幾種碳源的添加均利于T. versicolor CB1對直接大紅染料的脫色.其中，果糖與可溶性淀粉作為碳源的脫色效果更好，蔗糖、麥芽糖、葡萄糖作為碳源條件下的脫色效果依次減弱.由圖 4b可知，與不添加氮源相比，添加蛋白胨、氯化銨、尿素作為氮源的脫色率反而更低，添加硫酸銨作為氮源與不填加氮源的脫色率相近，而硝酸銨作為氮源條件下的脫色率高于不添加氮源條件下的脫色率.由此確定最佳碳源為果糖，最佳氮源為硝酸銨.方差分析結果顯示，Sig.值 < 0.05，表明不同碳源和不同氮源對T. versicolor CB1脫色直接大紅染料的影響均顯著.

　　圖 4碳源(a)和氮源(b)種類對菌株CB1脫色直接大紅的影響

　　3.4 pH對T. versicolor CB1脫色直接大紅的影響

　　不同pH條件下菌株CB1對直接大紅9 d內的脫色效果見圖 5.由圖可知，與pH自然條件下的脫色率相比，pH=9、11、3條件下的脫色率相對較低且依次減弱.而pH=7和pH=5條件下的脫色率均高于pH自然條件下的脫色率，且pH=5更利于菌株對直接大紅的脫色.由此可知，過酸和過堿的條件均不利于菌株CB1對直接大紅的脫色，而中性偏酸的條件更適合菌株CB1對直接大紅的脫色.方差分析結果顯示，Sig.值 < 0.05，表明pH對T. versicolor CB1脫色直接大紅染料的影響顯著.

　　圖 5 pH對菌株CB1脫色直接大紅的影響

　　3.5 金屬離子對T. versicolor CB1脫色直接大紅的影響

　　添加不同金屬離子條件下菌株CB1對直接大紅9 d內的脫色率變化見圖 6.由圖可知，添加ZnSO4、MgSO4、MnSO4條件下的脫色率均低于對照條件下的脫色率，且脫色率依次減弱.而添加FeCl3、CaCl2、CuSO4條件下的脫色率總體高于對照條件下的脫色率，且脫色率依次增高.故選擇CuSO4和CaCl2兩種金屬離子濃度作為2個因素進行后續的正交試驗.方差分析結果顯示，Sig.值 < 0.05，表明不同金屬離子對T. versicolor CB1脫色直接大紅染料的影響顯著.

　　圖 6金屬離子對菌株CB1脫色直接大紅的影響

　　3.6 正交試驗優化T. versicolor CB1對直接大紅的脫色

　　在單因素試驗的基礎上，選取果糖濃度、硝酸銨濃度、CuSO4濃度、CaCl2濃度作為4個因素進行3水平的正交試驗(表 1).正交試驗脫色7 d后的脫色率及分析結果見表 2.通過表 2中各因素不同水平均值Ki的比較可得到每個因素的最大平均值，進而得出脫色的最優組合為A2B3C2D3，即果糖濃度10 g·L-1、NH4NO32 g·L-1、CuSO4 1 mmol·L-1、CaCl23 mmol·L-1.通過比較各因素不同水平的極差R可知RC>RA>RB>RD，即4個因素對染料脫色率的影響大小依次為：CuSO4濃度>果糖濃度>NH4NO3濃度>CaCl2濃度.正交試驗方差分析結果顯示，果糖濃度、硝酸銨濃度、CuSO4濃度、CaCl2濃度對T. versicolor CB1脫色直接大紅染料的影響均顯著，且各因素對脫色的影響程度排序與極差分析結果相同.

　　表 2 正交試驗優化菌株CB1對直接大紅的脫色　　

　　3.7 正交試驗的驗證

　　按正交試驗最優組合A2B3C2D3，即pH=5、果糖10 g·L-1、硝酸銨2 g·L-1、CuSO4 1 mmol·L-1、CaCl2 3 mmol·L-1，配置染料發酵液，取此發酵液40 mL裝于100 mL三角瓶中，接種直徑8 mm菌絲3片，28 ℃下培養7 d的脫色率變化見圖 7.由圖可知，優化組合1~7 d的脫色率均高于對照組脫色率，優化組合在第7 d時的脫色率為78.23%，比對照組第7 d時的脫色率(63.07%)提高了24.04%.另外，正交驗證第7 d時的脫色率要高于正交試驗中9個試驗組合中的最高脫色率76.08%，表明正交試驗得當，結果可靠.

　　圖 7正交試驗驗證與對照脫色率

　　4 結論(Conclusions)

　　1) 本研究從野外朽木上分離得到一株可以有效降解直接染料的白腐真菌CB1，經形態學和分子生物學鑒定，菌株CB1被鑒定為變色栓菌(Trametes versicolor).

　　2) 為檢測T. versicolo CB1對直接染料的脫色能力，進行了T. versicolo CB1脫色固體條件下5種直接染料，結果表明，T. versicolo CB1對5種直接染料均可脫色，其中對直接大紅的脫色最為明顯.具體聯系污水寶或參見http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

　　3) 利用單因素試驗對T. versicolo CB1脫色直接大紅的脫色條件進行優化，優化的結果為：碳源為果糖，氮源為硝酸銨，pH=5，金屬離子為CuSO4和CaCl2.

　　4) 利用正交試驗進行T. versicolo CB1脫色直接大紅的優化，優化結果為：果糖10 g·L-1、硝酸銨2 g·L-1、CuSO4 1 mmol·L-1、CaCl23 mmol·L-1、pH=5，該條件下第7 d時的脫色率為78.23%，比優化前的脫色率提高了24.04%.