生物法一直是工業有機廢水處理重點研究的領域, 是處理有機廢水最常用、最經濟的方法之一, 隨著微生物檢測技術的不斷發展, 高通量測序技術的成熟與普及, 近幾年, 探究有機污染物的降解效率與微生物間的聯系、微生物群落結構及功能和廢水處理的相關性成為研究的熱點.有研究表明, 微生物群落具有很高的敏感性以及對多變環境的適應性, 群落結構在不同的廢水處理系統以及在同一廢水處理系統的不同運行時期、不同的運行工藝中都表現著差異, 環境參數改變時, 細菌群落的多樣性也會隨之變化.

　　焦化廢水中含有有毒/難降解物, 成分復雜, 可生化性較差, 被世界公認為目前最難治理的工業廢水, 如何提高焦化廢水的可生化性, 提高焦化廢水處理系統微生物的穩定性和降解效率, 一直是領域中的難點.過去的十年間, 焦化廢水處理工藝大部分采用A/O、A/H/O或者A/O2等先經過厭氧過程再到好氧過程的處理方法.相對于厭氧過程, 好氧過程有機物的分解比較徹底, 釋放的能量多, 有機物轉化速率快, 廢水能在較短的停留時間內獲得高的COD去除率.近幾年, 焦化廢水處理也開始直接從好氧階段開始, 形成了新的好氧-水解-好氧的新工藝.

　　在實際工程運行的啟動階段, 生物系統的微生物需要通過其他廢水處理工程提供大量的污泥進行培養, 因為市政污水處理廠污泥的生成量大, 相對容易獲取, 大部分焦化廢水處理工程的啟動階段都要部分或者全部接種市政污泥.李秀艷將市政污泥接種于焦化廢水中, 經過32 d的馴化使活性污泥對焦化廢水中酚和COD的去除率分別為99.8%及60.0%,; 筆者的團隊曾經設計了新建的4個焦化廢水處理工程, 全部采用市政污泥調試運行成功.目前對于焦化污泥馴化的研究大多只關注馴化后污泥對廢水的降解能力, 沒有涉及到微生物菌落的結構分析, 深入研究微生物群落的變化才能從本質上揭示整過馴化過程活性污泥降解性能改變的原因, 指導工程的調試與運行.本研究采集焦化廢水原水置于好氧反應罐中, 接種市政污泥, 檢測好氧降解過程中廢水成分的變化, 采用Illumina高通量測序平臺從種群和群落水平分析微生物群落的進化和演替過程, 討論環境因子和微生物菌群間競爭分別的作用機制.本研究工作的結果可以指導實際工程進水水質條件、工藝設計參數確定以及優化運行的決策.

　　1 材料與方法 1.1 焦化廢水與市政污泥的采集

　　實驗所用的焦化廢水(原水)采自寶鋼集團廣東韶關鋼鐵焦化廠酚氰廢水處理站隔油池進水口, 焦化廢水主要污染指標為COD 3857.26 mg·L-1、氨氮43.23 mg·L-1、硫氰化物480.25 mg·L-1、氰化物17.28 mg·L-1、揮發酚691.45 mg·L-1、pH=9.87.實驗所用的市政污泥采自廣州市瀝滘城市污水處理廠二沉池, 采集到的市政污泥先用尼龍紗網去除泥水混合物內的砂石等物質.

　　1.2 反應體系的構建及運行參數

　　實驗裝置如圖 1所示.

　　圖 1 攪拌反應釜示意

　　用1 mg·L-1鹽酸溶液將焦化廢水的pH調節至7.往反應器中加入適量處理后的焦化廢水, 將市政污泥接種于反應器中, 使泥水混合物的總體積為4 L(反應器總體積為5 L), 污泥的接種量為反應體系體積的20%, 實際測得接種污泥SV=21.0%、SVI=37.3 mL·g、MLSS=5 634.0 mg·L-1、MLVSS=3 562.0 mg·L-1、MLSS/MLVSS=0.63.投加0.25 g·L-1 K2HPO4作為磷源.反應器運行的溫度為30℃、pH控制在7~7.5、DO控制在2~5 mg·L-1.反應過程中不添加任何輔助碳源, 共運行144 h.

　　1.3 主要指標的檢測方法

        1.3.1 運行參數及污染物濃度的檢測

　　馴化過程中每間隔8 h對反應體系中的COD、苯酚、氨氮和硫氰化物的濃度進行測定, 以此來初步觀察污泥中微生物對廢水的適應狀態.其中, COD采用重鉻酸鉀微波消解法測定、苯酚采用液相色譜法測定、氨氮采用納氏試劑比色法法測定、硫氰化物采用鐵離子顯色分光光度法測定.用電極法測定運行過程中的pH和DO.用重量法測定MLSS.

　　1.3.2 微生物群落結構檢測

　　實驗使用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取污泥樣品DNA.稱取200 mg污泥樣品, 通過Buffer SCL裂解污泥樣品, 釋放出基因組DNA, 然后通過Buffer SP和氯仿去除蛋白質等雜質, Buffer SB去除樣品中腐殖酸, 避免對后續實驗的干擾.最后將所得DNA溶液置于-20℃保存, 用于后續實驗.

　　將上一步提取的樣品DNA進行PCR擴增, 擴增后的DNA樣品用1.5%瓊脂糖凝膠進行檢測, 以確定污泥樣品的DNA是否被提取出來.實驗所使用的通用引物為341f-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCG GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和534r(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′). PCR體系的組成為：25 μL的Taq PCR Master Mix、2 μL的DNA模板、2 μL的Primer 357f-GC、2 μL的Primer 518r、19 μL的Nuclease-free ddH2O, 共50 μL的體系. PCR擴增的條件為94℃預變性4 min, 94℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 32個循環, 72℃最終延伸10 min, 最后溫度降至4℃保存.

　　將經過檢測的樣品DNA送至廣州美格生物科技有限公司, 用Illumina高通量測序平臺進行微生物群落組成和多樣性檢測, 將馴化過程微生物群落的演變與污染物濃度變化建立對應分析.

　　2 結果與討論 2.1 污泥對焦化廢水的降解

　　投加市政污泥后, 反應器中焦化廢水的COD、苯酚、硫氰化物和氨氮濃度隨時間的變化分別如圖 2及圖 3所示.

　　圖 2 COD和苯酚隨時間的變化趨勢

　　圖 3 氨氮和硫氰化物隨時間的變化趨勢

　　該反應器中焦化廢水主要污染物質的起始濃度為COD 3 432.20 mg·L-1、苯酚469.04 mg·L-1、硫氰化物450.00 mg·L-1、氨氮41.10 mg·L-1, 經過144 h的反應后各物質的濃度變為COD 376.06 mg·L-1、苯酚0.36 mg·L-1、氨氮203.66 mg·L-1, 硫氰化物在反應96 h時其濃度已低于檢測下限(0.1 mg·L-1).這次反應中, COD的去除率為89.04%, 其中苯酚、硫氰化物的去除率更是高達99.92%、100%.由此可見, 市政污泥能在較短的時間內適應焦化廢水的劇毒環境, 并迅速降解廢水中苯酚、硫氰化物等污染物質.

　　從圖 2可以看出, 污泥對焦化廢水有一定的適應時間, 16 h前, COD、苯酚、硫氰化物和氨氮的濃度變化都不大, 16 h后, COD開始出現大幅度的降解, 24 h前降解了20.99%, 苯酚則在24 h仍然沒有變化, 24~40 h之間有一個很明顯的快速降解, 40 h苯酚已經降解了97.14%, 這個時候的COD降解和苯酚的降解趨勢相近, COD降解了58.95%.從圖 3可知, 硫氰化物和氨氮在72 h前的變化很小, 在72 h后硫氰化物開始迅速降解, 96 h時硫氰化物的濃度已經低于檢測限, 氨氮濃度則在72 h和96 h之間有較大上升, 隨后趨于穩定.

　　反應前16 h廢水的COD濃度并沒有出現較大的變化, 而且剛投加的市政污泥中微生物大多為異養型, 由此可推斷, 在這段時間內微生物群落還沒完全適應焦化廢水的環境, 無法利用廢水中的大部分碳源.經過16 h的適應期, 市政污泥內的微生物群落對COD的利用率逐漸增加, 但此時苯酚濃度仍然沒有變化, 說明此時的COD降低是微生物降解苯酚以外的污染物引起, 在24 h時苯酚的濃度也開始下降, 可初步推測在此實驗中污泥對苯酚的適應期是24 h, 反應器運行了72 h, 硫氰化物濃度才開始出現明顯的下降, 由于硫氰化物對污泥中部分微生物具有毒性抑制, 適應時間比較長, 此時COD和苯酚的濃度分別為1 144.06 mg·L-1和1.96 mg·L-1, 表明硫氰化物的降解是以苯酚基本被利用完作為條件.潘霞霞等研究了反應體系中苯酚濃度對硫氰化物降解的影響, 發現隨著苯酚濃度的增大, 硫氰化物被完全降解的時間增長, 證明了上述觀點.另外, 氨氮濃度隨著硫氰化物的降解開始顯著地升高, 理解為廢水中的氰化物、硫氰化物和有機氮等物質被氧化后釋放出氨氮, 表現出明顯的氨化過程特征.

　　2.2 污泥中微生物群落結構的變化

　　市政污泥在焦化廢水的環境中馴化, 其微生物菌落結構會發生相應的變化從而適應新的廢水環境.通過Illumina高通量測序對污泥中微生物菌落進行初步分析.其中A、B、C、D、E、F分別表示培養時間為0、16、40、72、96、144 h的活性污泥樣品.

　　從表 1中樣品的序列組成及OTU組成可知, 市政污泥投入焦化廢水中后, 運行16 h的污泥樣品序列和OTU組成從31 985、8 070下降至28 304、7 225, 說明焦化廢水對市政污泥的微生物群落表現出一定的毒性, 培養起始階段部分微生物死亡, DNA溶解.從表 2的Shannon指數和Simpson指數可知, 0 h和16 h的數值相差很小, 說明微生物群落多樣性幾乎沒有變化. 40 h的Shannon指數和Simpson指數有所下降, 即此時微生物多樣性比0 h和16 h略低. 72 h的OTU數、Shannon指數和Simpson指數又有所提升, 表明污泥在適應焦化廢水后, 微生物利用焦化廢水的污染物為營養物質生長, 造成序列數、OTU數比40 h時提高了, 同時Shannon指數和Simpson指數也同樣升高, 多樣性回復到0 h及16 h的水平.隨后的96 h, 污泥雖然適應了焦化廢水的環境, 焦化廢水中的大部分碳源已被利用, 微生物處在缺營養狀態, 氨氮的濃度快速上升, C/N比嚴重失衡, 高的氨氮濃度也會抑制微生物的生長, 部分微生物因不適應此環境而死亡, 故此時的序列數、OTU數開始下降, 微生物多樣性指數有較明顯的降低.如圖 4所示, 樣品的PCoA分析圖中兩個物種在坐標軸之間的距離越近, 表示兩個樣品的物種組成越相似, 從中可知：A和B組成相似, C和D組成相似, E和F組成相似, 這3組間的組成差異大, 與該3個時間段相對應的廢水污染物的組成成分也存在較大的差異, 表明微生物群落的結構變化是隨著廢水成分的改變及污染物成分的降解而相應改變.

 　　表 1 各樣品所含OTU數及序列分析

 表 2 各階段泥樣α多樣性參數結果統計

　　圖 4 樣品的PCoA(weighted unifrac)分析

　　面對新環境帶來的沖擊, 活性污泥中的微生物通過群落的演變與更替來逐步適應.從圖 5中可知, 活性污泥在整個反應過程中其微生物群落90%以上是由6種phylum水平的菌群構成, 分別是Firmicutes、Verrucomicrobia、Actinobacteria、Planctomycetes、Chloroflexi、Acidobacteria、Bacteroidetes、Proteobacteria, 其中Proteobacteria及Bacteroidetes占主導地位, 豐度分別為53.52%及38.57%(表 3), 與文獻的研究結果相似.整個反應過程中菌群在門水平上沒有很大的變化, 但是活性污泥中的優勢菌屬隨著廢水環境的改變而更替.從圖 6的污泥微生物群落的genus水平可以觀察到, 起始時污泥中的優勢菌屬為Dechloromonas、Thermomonas, 相對豐度分別為6.04%、4.73%(表 4); 在144 h的反應過程中, 其優勢菌屬在不斷地變化, 先是演變為Acinetobacter、Pseudomonas, 相對豐度分別為7.67%、5.37%;然后演變為Brevundimonas、Sphingobacterium, 相對豐度分別為4.16%、7.19%;最后演變為Fluviicola、Stenotrophomonas、Thiobacillus, 相對豐度分別為9.88%、4.46%、8.11%.可見, 在不斷變化的廢水環境中, 微生物群落會受到不同程度的沖擊, 群落中的優勢菌群發生變化, 活性污泥適應新的廢水環境并有效利用廢水中的殘余物質, 存在某種作用使降解與菌群之間建立了響應關系.

　　圖 5 phylum水平各樣品相對豐度分布

　　表 3 微生物菌落結構門水平上的組成

　　圖 6 genus水平各樣品相對豐度分布

 　　表 4 微生物菌落結構屬水平上的組成

　　2.3 污染物降解與微生物群落演變的聯系

　　結合4種環境因子的降解情況發現, 反應器運行在16~40 h之間, COD的濃度從3 135.59 mg·L-1降至1 408.90 mg·L-1, 苯酚濃度從469.04 mg·L-1降至13.42 mg·L-1, 與此同時, 污泥樣品則是從樣品B演變到了樣品C; 再結合genus水平物種相對豐度熱圖的分析, 又可發現, 經過了40 h的反應, Acinetobacter、Pseudomonas兩種菌屬的豐度明顯增大; 從表 4中可知, Acinetobacter和Pseudomonas的相對豐度分別從開始的時的0.64%、0.27%增加到7.67%、5.37%, Acinetobacter和Pseudomonas是兩種較為常見的酚類降解菌, 能降解焦化廢水中苯酚和間甲酚等結構較為簡單的酚類物質.上述現象均表明了演變的存在.

　　反應器運行在72~96 h之間, 硫氰化物的濃度從450.00 mg·L-1降至0.1 mg·L-1以下, 氨氮濃度從41.10 mg·L-1升至178.01 mg·L-1, 此階段是SCN-的降解階段及氨氮的積累階段.從圖 7可以看出, 從72~96 h, T78、WCHB1-05、Sphingobacterium、Longilinea、Brevundimonas、Lysobacter、Phenylobacterium、Chryseobacterium、Luteimonas等菌屬的豐度明顯增大.從表 4可以看出, 其中的Sphingobacterium、Brevundimonas、Lysobacter、Chryseobacterium增長最多, 所占的豐度最大, 分別從72 h的0.31%、0.86%、0.90%、0.24%增加到96 h時的7.19%、4.16%、3.22%、2.16%, 說明這幾種菌屬參與了硫氰化物的利用. Sphingobacterium、Brevundimonas菌屬也可以利用復雜的烴類物質作為碳源, 如喹啉、菲等焦化廢水常見的難降解有機物.黃會靜的研究表明Chryseobacterium為焦化廢水中可高效降解硫氰化物的菌屬, 即菌種豐度的變化受污染物或營養成分的誘導.

　　圖 7 genus水平的前30個物種相對豐度熱圖

　　隨著苯酚、硫氰化物等主要能量物質的用盡, 廢水中的微生物結構也隨之變化, 到144 h的測試發現, 優勢菌屬變為Fluviicola、Stenotrophomonas及Thiobacillus, 豐度從96 h的0.55%、2.88%、0.42%增長為9.88%、4.46%、8.11%. Thiobacillus是硫化細菌, 氧化還原態硫化物或單質硫為硫酸, 表現為專性化能自養.硫氰化物在降解的過程中會生成NH3、NO2-和S2-等代謝產物, Thiobacillus利用這些代謝產物繁殖并成為主要菌屬. Stenotrophomonas、Fluviicola分別屬于變形菌門的γ-Proteobacteria綱、擬桿菌門的Flavobacteria綱, γ-Proteobacteria和Flavobacteria普遍存在于含硝態氮的廢水中且γ-Proteobacteria綱和Flavobacteria綱的菌屬對硝態氮具有較好的利用能力.

　　從測序結果可知, 整個反應過程硝化細菌和亞硝化細菌沒有占到優勢, 在各種相對豐度熱圖(圖 7)中沒有被統計出來, 圖 3的實驗結果也反映了體系中的氨氮濃度沒有下降.在反應的起始階段, 焦化廢水對市政污泥中的微生物具有較強的毒性抑制, 如氰化物對硝化細菌的強的抑制作用存在, 同時起始時的氨氮濃度較低, 使得硝化細菌在培養起始階段無法快速繁殖.到了反應的中后期, 雖然氨氮濃度較高, 但此時廢水中的碳/氮比較小, 在后期, Thiobacillus成為優勢菌, 氧化硫為硫酸, 反應液的pH值下降, 而硝化菌適合在弱堿性的環境中生長, 解析了本實驗的中后期, 在沒有調節碳/氮比和pH的情況下, 硝化細菌和亞硝化細菌不能快速繁殖的現象.

　　從上述的結果及分析可知, 污染物成分和濃度的變化直接改變污泥中微生物所處的生存環境, 從而使得污泥中各個菌群的競爭力發生改變, 高濃度污染物質會促進適應該環境的降解菌生長繁殖, 這些菌群逐漸成為污泥微生物群落中的優勢菌群.廢水濃度變化帶來的環境改變可以促進活性污泥不同優勢菌群的構建, 即發生了微生物群落的演變.

　　3 結論

　　(1) 接種的市政污泥在克服焦化廢水毒性抑制并適應環境之后, 能夠有效降解廢水中的污染物質, 其中40 h時降解97.14%的苯酚, 96 h時的硫氰化物濃度已低于檢測限.

　　(2) 從苯酚降解到硫氰化物降解的不同階段中, 優勢菌群從Acinetobacter、Pseudomonas逐漸轉變為Sphingobacterium、Brevundimonas, Lysobacter及Chryseobacterium, 表明存在微生物群落演替受廢水組成的誘導作用, 其響應還涉及廢水的環境條件如pH值等.

　　(3) 在焦化廢水處理工程的調試及微生物馴化過程中, 客觀存在基于廢水環境的改變促使微生物菌群間的競爭關系加以適應, 從而導致污泥中優勢菌群的演變, 通過認識環境因子和微生物菌群間競爭對群落結構演變影響的規律, 可以成為工程啟動運行和穩態管理的科學工具.