由于大量工業廢水的排放、農業的長期過度使用化肥,導致環境水體中氨氮污染嚴重。而氮是引起富營養化的主要物質。

　　膜曝氣生物反應器(membrane aerated bioreactor, MABR)工藝具有曝氣量少、硝化與反硝化一體化、污泥發生量小以及運行管理方便等特點,是傳統工藝處理高需氧量廢水的一個引人注目的替代工藝,因此受到了世界各國水處理工作者的關注。由于在MABR 生物膜中存在明顯的分層現象,從而可以同時實現硝化反應、反硝化反應和異養氧化反應 。

　　20 世紀80 年代,研究人員發現了好氧反硝化菌,如副球菌pantotropha sp. ,糞產堿桿菌屬、假單胞菌等。之后越來越多的研究人員研究并篩選了好氧反硝化菌株 ,在有氧條件下好氧反硝化菌株可以去除氮。

　　本實驗篩選高效脫氮菌,并將其應用于膜曝氣生物反應器中進行強化研究,從而增強對廢水處理的效果,并利用此類反應器處理含氮廢水,從而使反應器具有高效、低耗的優點。

　　1　實驗材料與方法

　　1. 1 好氧反硝化菌篩菌

　　1. 1. 1 菌種來源

　　菌種來源取自西安市第四污水處理廠A2 / O 中曝氣池中活性污泥。

　　1. 1. 2 培養基

　　培養基選取參考文獻。

　　1)富集培養基。富集培養基由牛肉膏1. 0 g·L - 1 ,蛋白胨5. 0 g·L - 1 和硝酸鉀1. 0 g·L - 1 組成。

　　2)選擇性培養基。選擇培養基由Na2 HPO4 ·7H2 O 7. 9 g·L - 1 ,KH2 PO4 1. 5 g·L - 1 ,NH4 Cl 0. 3 g·L - 1 ,MgSO4 ·7H2 O 0. 1 g·L - 1 , 丁二酸二鈉4. 7 g·L - 1 ,KNO3 2. 0 g·L - 1 ,NaNO2 1. 0 g·L - 1 組成,pH 值在7 ~ 7. 5 之間。

　　3)平板分離培養基。平板分離培養基由Na2 HPO4 ·7H2 O 7. 9 g·L - 1 ,KH2 PO4 1. 5 g·L - 1 ,NH4 Cl0. 3 g·L - 1 ,MgSO4 ·7H2 O 0. 1 g·L - 1 , 丁二酸二鈉4. 7 g·L - 1 ,KNO3 2. 0 g·L - 1 ,NaNO2 1. 0 g·L - 1 ,瓊脂18 g·L - 1 組成。

　　1. 1. 3 馴化及平板分離

　　將選取的活性污泥樣品接種至富集培養基,然后在25 ℃ 和160 r·min - 1 的搖瓶中培養5 d,曝氣培養。之后將樣品接種至平板分離培養基,在25 ℃ 和160 r·min - 1 ,曝氣培養5 d。經過平板劃線分離純化后得到菌株。

　　1. 1. 4 復篩

　　獲得的菌株使用模擬污水(表1)進行復篩,在模擬污水的搖瓶中培養間歇曝氣,25 ℃ ,160 r·min - 1下培養5 d,進行復篩。選擇TN 去除率高于90% 以上的菌株。

　　重復上述步驟,得到純化后菌株。

　　1. 1. 5 菌種鑒定

　　采用提取菌株的DNA 并進行聚合酶鏈反應(PCR) ,擴增后的PCR 樣品由上海生工進行基因測序。具體方法為:

　　1)DNA 提取方法。于200 μL 的離心管中(預先加入30 μL 無菌雙蒸水)放入用接種環從培養基中挑出的數個單菌落,在94 ℃ 左右溫度下水浴加熱2 ~ 3 min 破壁,之后以該液體作為DNA 模板,進行PCR擴增。

　　2)PCR 擴增引物及程序。上游引物P1:27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’),下游引物P2:1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。

　　PCR 擴增程序如下:94 ℃ 預變性4 min,30 個循環(94 ℃ 變性45 s,60 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸90 s),最終72 ℃ 延伸12 min。

　　反應體系為:無菌雙蒸水40 μL,10 × PCR 反應緩沖液5 μL,4 × dNTP 溶液1 μL,10 mmol·L - 1 引物各1 μL,Taq 酶1 個單位,DNA 模板2 μL。

　　PCR 結果經上海生工生物工程公司測序,結果于美國NCBI 基因庫進行比對。

　　1. 1. 6 細菌形態

　　利用掃描電鏡觀察細菌形態。電鏡采用Philips XL-30。

　　1. 2 實驗裝置

　　1. 2. 1 反應器構建

　　本研究采用平行裝置運行法,即以同樣運行條件下的2 個相同的膜曝氣生物反應器進行水處理,其中一個實驗裝置加入篩選菌株運行(增強型反應器),而另一個實驗裝置不加篩選菌株(平行反應器),作為平行實驗裝置。

　　反應器示意如圖1。反應器裝置為圓柱形,膜組件置于反應器中央,呈倒傘型。反應器容積為5 L。膜組件為聚丙烯疏水性膜,有效面積為0. 2 m2 ,平均外徑為0. 5 mm,壁厚50 um,截留分子量為10 萬道爾頓。供氣壓力為7. 0 kPa。進水由蠕動泵從廢水池中抽出后,注入反應器中,反應器中的混合液經曝氣膜上生物膜處理后自流出水。

　　2 組反應器構造相同,不同點是膜曝氣組件膜面生物膜微生物組分不同。2 組反應器平行運行。加入所篩菌株的反應器簡稱為增強型反應器,不加所篩菌株反應器成為平行反應器。

　　1. 2. 2 掛膜

　　2 組反應器均采用間歇曝氣的運行方式進行掛膜,平行反應器接種污泥為西安市第四污水處理廠A2 /O 中曝氣池中活性污泥與曝氣沉砂池出水(表1)的混合液(體積比1 ∶ 1)(其中活性污泥投加量為4 g·L - 1 )。增強型反應器接種污泥為西安市第四污水處理廠A2 / O 中曝氣池中活性污泥、篩菌菌懸液(富集培養基培養)、曝氣沉砂池出水(表1) 的混合液(體積比1 ∶ 1 ∶ 1) (其中活性污泥、篩菌菌懸液投加量均為2 g·L - 1 )。

　　將混合液以懸浮態分別加入到各自反應器中,循環24 h 后排空,重新加入混合液后繼續進行循環,一周后觀察到膜上有黃褐色生物膜形成,于是開始連續進水并逐漸加大進水負荷,15 d 后膜面黃褐色生物膜加厚并布滿膜面,認為掛膜成功。

　　1. 3 實驗用水

　　實驗用水采用西安市第四污水廠曝氣沉砂池出水,水質情況如表1 所示。

表1　廢水水質情況

　　1. 4 水質測定方法

　　COD、氨氮和總氮等測定方法均參考《水和廢水監測方法》第4 版。其中COD 測定方法為重鉻酸鉀法(P210-213);氨氮測定方法為納氏試劑光度法(P276-281);總氮測定方法為過硫酸鉀氧化紫外分光光度法(P254-257)。測定數據均做平行實驗,取均值。

　　1. 5 變性梯度凝膠電泳( DGGE)

　　取1 000 μL 的生物膜樣品(超聲震蕩30 min),進行1. 1. 5 的步驟,完成后取PCR 擴增產物80 μL 在JY-TD331 型DGGE 電泳儀中進行分離。其中,聚丙烯酰胺濃度為8% ,凝膠厚度0. 75 mm。凝膠變性梯度采用30% ~ 70% 。電泳緩沖液為1 × TAE(三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸),電泳溫度60 ℃,電壓150 V,電泳時間7. 5 h。電泳完成后,采用溴化乙錠(EB)染色法染色20 min,之后在紫外燈下觀察拍照。

　　2　運行結果與討論

　　2. 1 菌種鑒定

　　經過復篩后,一株脫氮率在90% 以上的菌株被篩選出來。圖2 為菌株的掃描電鏡圖片,為短桿狀。菌株為革蘭氏染色陰性菌。

　　圖3 給出了菌株DNA 經PCR 擴增后的瓊脂糖電泳,從圖中可以看出,陰性對照良好。PCR 擴增序列可以進行測序,經上海生工公司測序后,結果輸入NCBI 數據庫比對可初步鑒定為假單胞菌Pseudomonassp. 菌屬(表2)。

表2　菌株測序結果

　　2. 2 污染物處理效果

　　根據汪舒怡等的研究結果,采用水力停留時間為5 h,運行負荷為7. 6 g COD·(m2 ·d) - 1 。由于處理的水樣及選取的污泥均取自同一污水廠,因此本研究未進行污泥馴化,掛膜后直接進入污染物去除階段,主要考察平行反應器對污水的去除效果。圖4 為運行期污染物去除的效果。

　　從圖4(a)中可以看出,2 組反應器COD 的去除效率均較高,COD 的去除率基本穩定在85% 以上,增強型反應器中比平行反應器的COD 的去除率高出約2% ~ 3% ,說明所篩菌株反硝化時消耗了一定的碳源。

　　圖4(b)顯示了氨氮隨時間的運行結果,氨氮去除率可達到90% 以上,氨氮去除率在兩種反應器中也較為接近,這說明膜曝氣生物反應器工藝對氨氮有較好的去除。

　　圖4(c)為總氮的去除情況,2 組反應器對總氮的去除也很好,顯示了膜曝氣生物反應器工藝脫氮性能的優越性。從運行開始,增強型反應器比平行反應器的要高出5% 左右,隨著運行時間的增加,總氮有了更好的去除,增強型反應器比平行反應器脫氮率高出10% 左右,總氮去除率達到85% ,這說明篩菌微生物起到了很好的脫氮作用。

　　2. 3 膜面微生物變化

　　為了更好地了解膜面微生物的組分,對運行后期膜曝氣上生物膜進行了變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。之后割膠,再按1. 1. 5 的方法測序,得到結果如圖5 及表3 所示。從圖5 可以看出,2 組反應器的膜面生物多樣性較好,條帶比對顯示,微生物種類基本一致,僅僅在亮度上有所不同,尤其是條帶6,可以看出,增強型反應器比平行反應器增多,應該為所篩菌株。經測序后的結果表3 中可以證實。從微觀上證明了所篩菌種發揮了重要作用。

表3　DGGE 圖譜中分離出條帶測序結果

　　從表3 中可以看出,條帶中表現出的菌株為Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas sp. 亞硝化單胞菌屬,Nitrosospira 亞硝化螺菌屬,其余則為污染物降解菌,如變形桿菌屬( Uncultured beta proteobacteriumBa1. 0, Uncultured beta proteobacterium Ch6S)。

　　2. 4 純菌株獨立掛膜研究

　　為了進一步對篩選的菌株獨立掛膜,考察是否該菌株確有好氧反硝化的作用,本研究在傳統反應器基礎上僅添加所篩選菌株構建獨立掛膜反應器,并同時再次運行平行實驗裝置,3 組進行對比研究。掛膜方式及運行與1. 2. 2 及2. 2 相同。經運行30 d后發現,與2. 2 污染物去除結果相類似,3 組反應器COD 的去除效率均較高,COD 去除率基本穩定在85% 以上,相差不大。氨氮隨時間的運行結果,氨氮去除率可達到90% 以上,氨氮去除率在3 種反應器中也較為接近。獨立掛膜反應器與增強型反應器對總氮的去除率分別達到85% 和84% ,而平行反應器對總氮的去除率為73% 。從圖4 看出,增強型反應器與平行反應器對總氮的去除率分別達到85% 和75% 。因此,重復實驗與前期實驗無顯著性差異。

　　研究認為:獨立掛膜反應器脫氮效果良好,但是污染去除效果與增強型反應器相差不大,從經濟角度和生物多樣性角度認為增強型反應器更適合于污水處理。具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

　　3　結論

　　1)篩選一株好氧反硝化菌,其脫氮效率為90% 以上,經鑒定為假單胞菌Pseudomonas sp. 。

　　2)將菌株添加到膜曝氣生物反應器構建高效脫氮菌群增強膜曝氣生物反應器來處理市政污水。研究表明,對于高效脫氮菌的附著下形成的增強型膜曝氣生物反應器,在COD 負荷為7. 6 g COD·(m2 ·d) - 1 ,水力停留時間為5 h 下,可使污染物的COD,氨氮及總氮的去除率分別保持在87% 、98% 和85%以上。

　　3)DGGE 分析顯示,2 組反應器的膜面生物多樣性較好。測序結果表明,篩選菌種在增強型膜曝氣生物反應器中比平行膜曝氣生物反應器明顯增多,從微觀上證明了菌種發揮了重要作用。