城市污水從用水設施排出時，自身是不含或者僅含有極少量的硝化菌. 但是，城市排水管道內表面、 管底沉積物和污水中存在了大量高活性的微生物. 城市污水從排放口，經過排水管道、 明渠等下水管網長達數小時甚至十幾小時的輸送，到達污水處理廠時，往往會由于管渠壁上生物膜的脫落等原因可能會含有一定量的硝化菌. 這也是在城市污水處理廠的啟動時，采用傳統的自然培養方法或利用初沉污泥以進行快速自然培養可以達到良好的硝化效果的原因. Brion等運用PCR和Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量測序技術對加拿大魁北克省蒙特利爾市附近的3個污水廠的進水及活性污泥中硝化菌群落結構進行調查分析，發現活性污泥中的硝化菌多樣性低于進水中硝化菌多樣性，而且78%的AOB和86%的NOB一致. Saunders等對Denmark的3個污水廠的進水與活性污泥進行微生物群落多樣性測序分析發現，活性污泥中有35%OTUs(62% reads)存在于進水中. 但是Lee等利用16S rRNA基因序列分析法對韓國首爾的4個污水廠的進水與活性污泥中微生物進行鑒定，發現二者僅有4.3%~9.3%的OTUs一致，從而認為原水中微生物對活性污泥系統的影響較小. 常用的活性污泥模型ASM1、 ASM2和ASM3都假定進水中的硝化菌(自養菌XA)含量也是設定為0 mg·L-1，并假定相對過程中生成的微生物量，進水中微生物質量濃度可以忽略. 而目前許多有關硝化菌的研究集中在生化系統內，對于城市污水自身帶入系統的硝化菌很少涉及，而要了解這部分硝化菌對污水處理廠活性污泥系統的影響，就需要明確以下3個問題: ①城市污水中是否含有活性污泥中硝化菌的優勢菌屬? ②這部分硝化菌是否具有硝化活性?③如果城市污水與活性污泥中硝化菌一致，而且具有硝化活性，那么這部分硝化菌對活性污泥系統將有著連續自然接種的作用，而城市污水處理廠進水帶入的這部分硝化菌對活性污泥系統的連續接種強度有多少?

　　本研究利用熒光原位雜交技術等方法對西安市兩個已運行多年的大型污水處理廠(西安市第二、 第三污水處理廠)進水中的硝化菌群落結構與硝化性能進行初步調查分析，并通過硝化活性估算進水中硝化菌對活性污泥系統的連續接種強度，以期為活性污泥模型的優化及城市污水處理系統的設計與運行提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

　　西安市第二污水處理廠(二污)、 西安市第三污水處理廠(三污)樣品取自曝氣沉砂池出水，取樣間隔為一至兩周，連續調查4個月.

　　西安市第二污水處理廠主要服務南二環路以南到南三環路之間和曲江池以西的區域，服務面積為53.5 km2，自運行以來，污水廠一期自運行以來的日處理能力為10×104～13×104 m3·d-1; 西安市第三污水處理廠主要服務紡織城地區，一期日污水處理能力約10×104m3·d-1，其中工業污水、 生活污水量大約各占一半，服務面積為25.09 km2. 兩個污水廠進水為典型的城市污水.

1.2 熒光原位雜交

　　樣品用1×PBS緩沖溶液洗滌3次，然后用4%的多聚甲醛固定2 h，再用1×PBS緩沖溶液洗滌3次. 實驗中采用的探針序列及雜交條件見表 1，其中氨氧化細菌采用CY3標記，亞硝酸鹽氧化細菌采用CY5標記，Comp Ntspa662、 Comp NIT3無熒光標記，EUB采用FITC標記. 按照雜交緩沖液中甲酰胺濃度由低到高的順序進行雜交.

　　樣品雜交后用封片劑封片，并在共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8 X,Leica Microsystems,Mannheim,Germany)下觀察. 每個樣品隨機取10~20個視野，最終結果采用Leica Microsystems LAS AF-TCS SP8軟件分析.

　　實驗中以NSO1225探針雜交的細菌數量表示氨氧化細菌(AOB)總數量，亞硝酸鹽氧化細菌(NOB)的總數是以Ntspa662、 NIT3、 Ntcoc206和Ntspn693所雜交的細菌數量的總和表示，總細菌數量是以EUBmix所雜交的細菌數量表示，AOB和NOB數量各占真細菌比例計算參照張巖等的方法.

1.3 硝化速率測定

　　5~10 L水樣離心(12 000 r·min-1，Z36HK離心機，Beckman Coulter Inc.,USA)濃縮，離心后的污泥再稀釋至1 000 mL，將溫度控制在20℃，pH控制在7.5. 曝氣3~4 h，以去除污泥中少量未淘洗干凈的有機物. 測定氨氧化速率時，加入疊氮化鈉(濃度為24 μmol·L-1)以抑制NOB呼吸，測定亞硝酸鹽氧化速率時，加入聚丙烯基硫脲(濃度為86 μmol·L-1)，前一至兩小時測定內源呼吸速率(溶解氧儀，Seven2Go S9,Mettler Toledo)，內源呼吸速率(以N計)穩定后分別加入30mg·L-1的NH4Cl和NaNO2，測定氨氧化速率和亞硝酸鹽氧化速率.

2 結果與討論

2.1 城市污水中硝化菌群落結構

　　圖 1為城市污水樣品的熒光原位雜交照片(綠色為CY3 標記的AOBmix，紅色為Cy5標記的NOBmix，藍色為FITC標記的EUBmix). 采用Leica Microsystems LAS AF-TCS SP8軟件對雜交照片進行統計分析，二污與三污進水中硝化菌占總細菌數的平均個數百分比[(AOB+NOB)/EUBmix]分別為(5.35±2.1)%和(6.0±2.8)%，與硝化正常的二污與三污活性污泥中硝化菌百分含量接近[平均分別為(6.6±1.5)%和(8.4±3.1)%][16]. 這個結果證實了進入生物反應池的城市污水中存在大量的硝化菌.

　　由于城市污水的來源包括工業廢水和生活污水，自身一般都不會含有硝化菌，所以這部分硝化菌很有可能是在城市污水管網輸送過程中產生，雖然一般認為城市污水處于缺氧或者厭氧狀態，但是由于城市污水管網非滿流設計、 城市污水輸送過程中存在跌水甚至明渠等原因，空氣中的氧會不斷傳遞至城市污水中，從而為硝化菌的繁殖創造一定的條件，但是城市污水中硝化菌的確切來源有待進一步調查分析. Brion等發現城市污水中硝化菌的含量與排水管網的服務面積正相關，服務面積越大，硝化菌濃度越高.

　　圖 2和圖 3分別為兩個污水廠進水中AOB和NOB的硝化菌群落結構分布. 從中可以看出，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage為城市污水中氨氧化菌的優勢菌，同時也檢測到Nitrosospira的存在，與二污和三污活性污泥中氨氧化菌群落結構接近. 以往研究中對城市污水中的硝化菌優勢菌屬的檢測尚未見到，一般都集中在污水處理系統內的活性污泥中，而對活性污泥的檢測中，Limpiyakorn等發現在城市污水傳統活性污泥法處理系統中，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage為氨氧化菌的優勢菌; Siripong等對7個污水處理廠分別在冬季和夏季進行硝化菌群落結構調查，發現盡管污水廠在冬季和夏季的溫度、 污泥齡不同，但是其中氨氧化菌的優勢菌均為Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage，冬季Nitrosospira份額略有增加. Wang等和曾薇等對多個污水處理系統中的氨氧化菌群落結構進行分析，也發現氨氧化菌優勢菌均為Nitrosomonas. 在硝化運行正常的北石橋和第三污水處理廠的進水中氨氧化優勢菌與以上諸多研究中的活性污泥的氨氧化優勢菌一致，均為Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage. 這個結果也可根據K/r繁殖策略解釋，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage屬于r-strategists，Nitrosospira屬于K-strategists，Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage (r-strategists)在高氨氮濃度條件下更具競爭優勢. 而調查期間二污與三污城市污水中氨氮平均濃度分別為 38.5mg·L-1和39.9 mg·L-1，因此在城市污水中Nitrosomonas europea(r-strategists)與Nitrosospira(K-strategists)相比，更具競爭優勢.

　　由圖 3可以看出，進水中NOB的優勢菌均為Nitrospira，次優勢菌為Nitrobacter，且與Nitrococcus、 Nitrospina并存，與二污和三污活性污泥中亞硝酸鹽氧化菌群落結構接近. Jauffur等運用PCR和Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量測序技術對加拿大魁北克省蒙特利爾市附近的3個污水廠的進水與活性污泥中的Nitrospira細菌進行分析，結果發現城市污水中平均有99個細菌分類操作單位(OTUs)，而活性污泥中僅有83個細菌分類操作單位(OTUs). 這些結果證實城市污水中存在大量的Nitrospira，而且其多樣性高于活性污泥. 而污水廠活性污泥中Nitrospira與Nitrobacter并存，而且Nitrospira是活性污泥系統中NOB的優勢菌屬. 這說明常規活性污泥中亞硝酸鹽氧化菌的優勢菌屬也大量存在于城市污水中. 這些結果同樣可以利用K/r繁殖策略解釋，Nitrobacter屬于r-strategists，Nitrospira屬于K-strategists，而一般城市污水中亞硝鹽濃度低于常規檢測方法的檢測下限，活性污泥系統中亞硝酸鹽濃度一般也低于1mg·L-1，因此在活性污泥系統中Nitrospira與Nitrobacter相比，更具競爭優勢，而城市污水中由于亞硝酸鹽濃度更低，Nitrospira的競爭優勢更為明顯.

2.2 城市污水中硝化菌活性

　　為考察城市污水處理廠進水中硝化菌的活性，實驗采用呼吸法對檢測兩個污水處理廠進水中硝化菌的氨氧化速率和亞硝酸鹽氧化速率進行測定.

　　圖 4和圖 5分別為進水中硝化菌在加入氨氮和曝氣后，氨氧化速率、 亞硝酸鹽氧化速率隨時間的變化趨勢，從中可以看出，與常規活性污泥硝化性能測定不同的是，原污水中硝化菌在曝氣初期活性較低，氨氧化菌活性在曝氣2~12 h后，亞硝酸氧化菌活性在曝氣6~16 h后，活性基本恢復至最大值. 亞硝酸鹽氧化菌活性恢復所需要的時間比氨氧化菌活性恢復所需要的時間長. 調查期間二污進水中平均最大氨氧化速率為(0.32±0.12) mg·(L·h)-1，平均最大亞硝酸鹽氧化速率為(0.71±0.18) mg·(L·h)-1; 三污進水中平均最大氨氧化速率為(0.43±0.17) mg·(L·h)-1，平均最大亞硝酸鹽氧化速率為(0.58±0.27) mg·(L·h)-1. 因此，可以判斷出，城市污水中的氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌具有硝化活性，在建立活性污泥模型及污水廠設計時，應當考慮城市污水中硝化菌對活性污泥系統的影響，但也應當充分考慮進水中硝化菌所需要的適應時間.

2.3 城市污水中硝化菌對活性污泥系統的影響

　　調查結果表明，城市污水中含有活性硝化菌，這部分硝化菌將對活性污泥系統進行自然連續接種(natural continuous seeding). 為了衡量城市污水中硝化菌對活性污泥系統的影響，定義每天由城市污水帶入的硝化菌數量與活性系統中原有硝化菌數量的比值為原污水中硝化菌對活性污泥的連續接種強度，可以根據公式(1)計算:

　　式中，qseed為硝化菌連續接種強度，g·(g·d)-1; Qin為城市污水處理廠的日進水量，L·d-1; Xin,nitrifiers為城市污水中硝化菌濃度，mg·L-1; V為城市污水處理廠生物反應池的容積，L; Xnitrifiers為活性污泥中硝化菌濃度，mg·L-1.

　　表 2為調查期間二污與三污進水與活性污泥的硝化活性平均值，以及根據公式(1)所計算的添加強度.

　　由表 2可以看出，城市污水每天給活性污泥系統帶入了大量的具有硝化活性的硝化菌，氨氧化菌連續接種強度在0.08~0.09 g·(g·d)-1，亞硝酸鹽氧化菌連續接種強度在0.11~0.24 g·(g·d)-1. 低于Jauffur等所計算加拿大LaPraire污水處理廠0.3g·(g·d)-1的接種強度，該廠的進水流量為65 000 t·d-1，HRT為15 h，SRT為7 d，二級處理工藝采用傳統活性污泥法. LaPraire污水處理廠的溫度與污泥齡低于本研究所調查的污水處理廠，而接種強度會受進水中硝化菌濃度與活性污泥硝化菌濃度的影響，溫度越低，污泥齡越短，活性污泥中硝化菌的含量就會大幅降低，而進水中硝化菌的接種效應就會越明顯.

　　但這些結論與Lee等調查發現的進水與活性污泥中的微生物僅有4.3%~9.3%的OTUs一致，并得出進水中微生物對活性污泥系統的影響較小這一觀點相矛盾. 引起這一矛盾的原因可能是因為: 硝化菌生長緩慢，活性污泥系統中硝化菌自身增殖的數量少，由城市污水帶入的硝化菌對活性污泥系統的影響較大，因此二者硝化菌種群結構接近. 而異養菌則相反，它在活性污泥系統中增殖的數量遠大于城市污水帶入的異養菌數量，因此異養菌的種群結構更容易受活性污泥系統的設計與運行條件的影響. 由于活性污泥中硝化菌的份額較小，Lee等的調查結果主要是針對異養菌.

　　Larsen等在2008年的研究結果中表明硝化菌尤其是亞硝酸鹽氧化菌比活性污泥中一般的細菌更容易形成密實和牢固的小菌落，從圖 1城市污水樣品的熒光原位雜交照片中也可以觀察到這個現象. 根據這一特性，如果污水處理工藝中包含初沉池時，進水中的大部分硝化菌將進入初沉污泥. 因此，在活性污泥模型及污水處理廠的設計尤其是初沉池的設計中有必要考慮由城市污水自身帶入的硝化菌對污水處理廠運行的影響.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

3 結論

　　(1) 西安市第二、 第三污水處理廠進水中硝化菌占總細菌數的平均個數百分比[(AOB+NOB)/EUBmix]分別為(5.35±2.1)%和(6.0±2.8)%，進水中氨氧化菌(AOB)優勢菌為Nitrosomonas europaea/Nitrosococcus mobilis lineage; 亞硝酸鹽氧化菌(NOB)的優勢菌均為Nitrospira，次優勢菌為Nitrobacter，且與Nitrococcus、 Nitrospina并存.

　　(2) 城市污水中硝化菌具有硝化活性，在曝氣2~16 h后，活性基本恢復，最大氨氧化速率分別為(0.32±0.12) mg·(L·h)-1和(0.43±0.17)mg·(L·h)-1，亞硝酸鹽氧化速率為(0.71±0.18)mg·(L·h)-1和(0.58±0.27) mg·(L·h)-1.

　　(3) 城市污水中含有活性硝化菌，對活性污泥系統有連續自然接種的作用，根據進水及活性污泥中硝化活性估算出城市污水中AOB和NOB對活性污泥的連續接種強度分別為0.08~0.09 g·(g·d)-1和0.11~0.24 g·(g·d)-1. 因此，在活性污泥模型建立及污水處理廠設計中有必要考慮由城市污水自身帶入的硝化菌對污水處理廠運行的影響.