ANAMMOX是近年來興起的具有較好經濟效能和較高脫氮效能的生物脫氮工藝，與傳統的脫氮工藝相比具有需氧量低、 運行費用低和不需外加碳源等優點，從產生至今受到了國內外研究者的廣泛關注[1, 2, 3]，其在垃圾滲濾液[4, 5]、 蝕刻液廢水[6]、 豬場廢水[7, 8]、 城鎮污水[9]、 污泥消化液上清液[10]等高氨氮廢水中得到了廣泛研究.
煉油、 煉焦、 石油化工等行業生產廢水是一類低C/N比、 高氨氮的工業廢水，用傳統工藝處理成本較高且很難達標，而用ANAMMOX工藝就能夠很好地解決這類問題. 但苯酚作為一種常見的有機物是該類廢水中不可避免的成分，會對微生物產生抑制作用[11, 12, 13]，若要用厭氧氨氧化工藝處理該類廢水，需要研究苯酚對ANAMMOX菌的影響. 目前雖然有研究者在小試的條件下將ANAMMOX工藝應用于焦化廢水等含苯酚廢水處理[14, 15]，但關于苯酚對ANAMMOX菌的影響的相關報道較少.
本文研究了不同濃度的苯酚對ANAMMOX污泥脫氮效能及污泥形態的影響并對其影響過程進行初步探究，以期為ANAMMOX工藝應用于高氨氮含酚廢水提供一些借鑒.
1 材料與方法
1.1 實驗裝置及運行條件
實驗運行裝置采用100 mL和250 mL規格的血清瓶，螺旋蓋密封. 裝置運行條件： 血清瓶放在恒溫氣浴振蕩箱中，溫度為33℃恒定; 轉速為125 r ·min-1; 進水pH值為7.8-8.2，通過0.25mol ·L-1的HCl調節控制; 進出水方式為全進全出. 反應前用高純氮氣對裝置曝氣30 min，將水中的溶解氧除去.
1.2 接種污泥來源與實驗廢水
接種的污泥是實驗室穩定運行4 a的具有較高活性的ANAMMOX顆粒污泥，顏色為紅色，MLVSS/MLSS為0.42.
實驗廢水采用模擬廢水，主要成分為NH4Cl(NH4+-N 100 mg ·L-1)、 NaNO2(NO2--N 130 mg ·L-1)、 NaHCO3 2 000 mg ·L-1、 KH2PO4 27 mg ·L-1、 CaCl2 ·2H2O 136 mg ·L-1、 MgSO4 ·7H2O 200 mg ·L-1. 微量元素濃縮液Ⅰ成分為: EDTA 5 000 mg ·L-1，FeSO4 5 000 mg ·L-1; 微量元素濃縮液Ⅱ成分為: EDTA 5 000 mg ·L-1，ZnSO4 ·7H2O 430 mg ·L-1，CoCl2 ·6H2O 240 mg ·L-1，MnCl2·4H2O 990 mg ·L-1，NaMoO4 ·2H2O 220 mg ·L-1，NiCl2 ·6H2O 190 mg ·L-1，NaSeO4 ·10H2O 210 mg ·L-1，H3BO4 14 mg ·L-1. 其中微量元素Ⅰ投加量為1 mL ·L-1，微量元素Ⅱ投加量為1.25 mL ·L-1. 苯酚儲備液濃度為50 g ·L-1.
1.3 實驗方法
1.3.1 短期內苯酚對厭氧氨氧化污泥脫氮效能的影響
為使接種污泥的脫氮性能相近，提高實驗準確度，將含水的ANAMMOX污泥進行泥水分離，然后將分離后的顆粒污泥等分為18份，每份約2 g，分別置于18個100 mL的血清瓶中. 32℃恒溫氣浴振蕩器連續培養15 h之后，根據脫氮效能將18個瓶子由高到低排列，采用取平均數法，將脫氮效能最好的4個和最差的4個去掉，選用中間去除效果接近的10個(去除率差值不大于5%)，以進一步保證污泥得到等分.
對剩余的10個血清瓶進行序號標記并加入不同濃度的苯酚溶液，使其濃度分別為0、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800和1 000 mg ·L-1. 經過15 h培養反應后，測定進、 出水pH、 NH4+-N、 NO2--N、 NO3--N和苯酚值，評估苯酚濃度對ANAMMOX污泥脫氮性能的影響. 以上實驗重復2次.
1.3.2 長期內苯酚對厭氧氨氧化污泥脫氮效能的影響
采用相同的方法選取性狀相似的污泥約2 g裝于250 mL的血清瓶中進行長期影響實驗. 初始運行周期設定為1 d，等脫氮效能穩定后逐步提高進水苯酚濃度,直至出現脫氮效能明顯下降，當ANAMMOX污泥脫氮效能處于穩定抑制狀態后，停止投加苯酚，研究其恢復情況來判斷抑制的可逆性.
1.4 分析方法
方法均參照文獻[16]. NH4+-N:納氏試劑分光光度法; NO2--N: N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N： 紫外分光光度法; pH:哈納pH211型酸度計; 苯酚： 4-氨基安替比林直接光度法; MLSS 和MLVSS: 重量法; TN： 實驗環境為無機環境，因此以NH4+-N、 NO2--N和NO3--N三者之和表示TN.
2 結果與討論
2.1 短期內苯酚對厭氧氨氧化污泥脫氮效能的影響
保持進水NH4+-N濃度100 mg ·L-1、 NO2--N濃度130 mg ·L-1左右,經過15 h反應后,結果如圖 1所示，隨著水中苯酚濃度的增加，出水NH4+-N、 NO2--N濃度出現明顯的變化. 不加苯酚的作為對照，其出水NH4+-N、 NO2--N濃度分別為22.67 mg ·L-1、 62.60 mg ·L-1，NH4+-N的去除率為78.1%，TN去除率為56.7%. 當進水苯酚濃度為100 mg ·L-1時出水NH4+-N、 NO2--N濃度分別為65.7 mg ·L-1、 93.11 mg ·L-1，NH4+-N的去除率為34.3%，TN的去除率為24.8%，ANAMMOX污泥活性受到抑制. 隨著苯酚濃度增加其抑制更加明顯，當苯酚濃度大于600 mg ·L-1時，ANAMMOX污泥活性受到嚴重抑制，出水NH4+-N、 NO2--N濃度分別在90 mg ·L-1、 118 mg ·L-1左右，NH4+-N、 TN的去除率分別只有6%、 10%左右. 但此時TN去除率高于NH4+-N去除率，說明體系中TN的損失不僅僅由ANAMMOX反應引起的，還存在其他途徑，而從圖 1中可知體系中苯酚有降解，因此推測TN的損失與苯酚的降解有關，體系中可能存在著某種降解苯酚的微生物.
圖 1 短期內厭氧氨氧化污泥脫氮效能隨苯酚濃度的變化
李祥等[17]在做Cu離子對ANAMMOX的影響時把過程分為3個階段： 活性刺激階段、 穩定階段和抑制階段. 而本實驗在做苯酚對ANAMMOX污泥活性影響時，隨著苯酚的加入，NH4+-N和NO2--N的去除率一直呈現下降趨勢，并沒有出現活性刺激階段和穩定階段，只有1個階段，即抑制階段. 分析原因可能是因為部分微量重金屬是微生物維持生命活動所需的營養物質，也是酶的活化劑，少量加入時可以促進微生物生長[18]. 彭廈等[19]在研究鐵離子對ANAMMOX反應器脫氮效能影響時表明，當進水鐵離子濃度由0.04 mmol ·L-1提高到0.06 mmol ·L-1時，NH4+-N的去除率明顯升高，并達到相對穩定狀態; 當進水鐵離子濃度提升為0.08 mmol ·L-1時，NH4+-N的去除率進一步提高. 而鐵離子也正是ANAMMOX反應所需的微量元素之一. 但本實驗中所加的苯酚在工業上常用作抑菌劑，主要通過使微生物細胞內的原生質蛋白發生凝固或變性而起到殺菌作用，通常0.2%苯酚即有抑菌作用，苯酚濃度大于1%時能殺死一般細菌. 本實驗所加苯酚濃度為100-1 000 mg ·L-1(含量在0.01%-0.1%之間)，加入后不會立即殺死微生物，所以可以長期觀察苯酚對微生物的影響. 郁丹等[20]研究表明，在厭氧反應中加入100 mg ·L-1苯酚時就對反應產生了影響，當反應器中的苯酚濃度大于400 mg ·L-1時，苯酚已經對厭氧顆粒污泥表現出一定的毒性. 本實驗中當進水苯酚含量為100 mg ·L-1時，NH4+-N和TN的去除率均低于未加苯酚的的50%，表明苯酚在短期內對ANAMMOX菌的活性產生了嚴重的抑制; 而當苯酚濃度大于600 mg ·L-1時，ANAMMOX菌處于完全抑制狀態. Yang等[21]在研究苯酚和Cu離子聯合對ANAMMOX污泥活性影響時表明，兩者聯合的毒性主要依賴于苯酚濃度，當苯酚濃度為75 mg ·L-1時，污泥活性保留百分比只有48.7%，此時抑制率已經超過一半. 綜上，苯酚對厭氧污泥存在毒性，本實驗在研究苯酚對ANAMMOX污泥活性短期影響時只存在抑制階段.
2.2 長期內苯酚對厭氧氨氧化污泥脫氮效能的影響
長期實驗苯酚濃度采用從低濃度開始逐漸增加的方式進行，保持進水NH4+-N濃度100 mg ·L-1、 NO2--N濃度130 mg ·L-1左右不變，結果如圖 2所示. 反應運行初期(0-28 d)，當進水苯酚濃度由 60 mg ·L-1 逐步升高到100 mg ·L-1 時，ANAMMOX污泥對 NH4+-N、 NO2--N的去除率起初有所下降，但運行穩定后又逐漸提高，基本保持在99%以上，NO3--N生成量呈現穩定趨勢. 這與短期結果不同，說明低濃度苯酚對ANAMMOX菌有一個馴化的過程，當反應周期延長，ANAMMOX污泥逐漸適應了苯酚的環境，其抑制被減弱. 以后苯酚濃度以100 mg ·L-1為一個梯度，每提升一個梯度，NH4+-N、 TN的去除率都會出現先下降后上升的趨勢. 但隨著梯度的增加，抑制更加明顯，穩定后的NH4+-N最終去除率都會比上一個階段低. 當苯酚濃度提升至1 000 mg ·L-1時，NH4+-N的最終去除率降低到10%以下，TN的去除率也只有27%左右，此時ANAMMOX污泥受到了嚴重的抑制. 然而，NO2--N和NO3--N的變化趨勢與NH4+-N不太一樣，雖然也是先下降后升高，但當苯酚濃度大于200 mg ·L-1時，反應穩定后出水NO2--N和NO3--N均為0 mg ·L-1，NO2--N的其去除率達到了100%，生成的NO3--N也被完全降解. 當苯酚濃度為400 mg ·L-1后期時，NO2--N的去除率始終保持在100%，產物中沒有檢測到NO3--N. Zhu等[22]研究了厭氧反應器中苯酚和硝酸鹽的同步去除情況，將苯酚作為唯一電子供體，硝酸鹽作為唯一電子受體. 研究結果表明，經過110 d的馴化后，當進水苯酚和硝酸鹽分別為600 mg ·L-1和430 mg ·L-1，HRT為20.75 h，出水苯酚和硝酸鹽的去除率分別為95.5%和96.75%. 其結果表明，苯酚可以與硝酸鹽發生反硝化反應，導致硝態氮的減少. 本實驗中出水NO2--N和NO3--N減少正是由于苯酚的加入導致了反應體系內發生了反硝化反應導致的. 當苯酚濃度提高至1 000 mg ·L-1時，NO2--N的去除率再次受到影響，其去除率降為46.5%，出水也可以檢測到有NO3--N的生成，說明高濃度苯酚對反硝化反應也會產生影響. 在反應器運行至95 d時，將進出苯酚濃度降為0 mg ·L-1，觀察ANAMMOX污泥恢復情況. 經過18 d的恢復培養，NH4+-N的去除率逐步回升至99%以上，而NO2--N的去除率基本穩定在64%-65%之間，此時NH4+-N與NO2--N之間的轉化關系發生了變化.長期結果說明高濃度苯酚對ANAMMOX菌產生了嚴重的抑制，且短期內很難恢復到原來的狀態.
圖 2 長期實驗苯酚濃度對厭氧氨氧化脫氮效能的影響
2.3 苯酚對厭氧氨氧化污泥形態影響及恢復實驗
剛開始接種的ANAMMOX污泥，如圖 3(a)所示，顏色呈紅色. Strous等[23]研究表明，氨氧化細菌細胞內含有大量血紅素，當污泥顏色較紅時表明ANAMMOX污泥活性很好. 隨著苯酚的加入，反應到46 d后，反應器內出現絮狀物，污泥體積和顏色開始發生變化，紅色的污泥表層開始變為黑色絮狀，如圖 3(b)所示，此時苯酚對污泥產生了抑制[14]. 隨著苯酚濃度的增加，黑色絮狀向內擴增，表層的絮狀開始脫落，到第94 d，污泥只有核心的一點還呈現顆粒狀，但顏色仍為紅色，說明此時ANAMMOX污泥仍然具有活性，如圖 3(c)所示. 第95 d停止投加苯酚，改為加常規的營養液，經過18 d的修復后，污泥表層的黑色絮體逐漸變為紅色，污泥顏色部分恢復,如圖 3(d)所示. 此時NH4+-N的去除率得到恢復，但污泥量減少，部分微生物死亡，由于ANAMMOX菌時代周期較長(11 d)，所以短期恢復無法使微生物量快速增加. 整個過程中，隨著NH4+-N去除率的變化污泥顏色會發生變化，因此可以將污泥的顏色作為視覺上評判ANAMMOX污泥活性受抑制程度的一個依據. 然而恢復后ρ(NO2--N)去除/ρ(NH4+-N)去除/ρ(NO3--N)生成平均值為1 ∶0.86 ∶0.2，與氨氧化理論化學計量比為1 ∶1.32 ∶0.26有很大差別. 猜測原因可能是當苯酚存在時反硝化細菌和ANAMMOX細菌競爭NO2--N，從而使ANAMMOX細菌在利用較少NO2--N時就可以發生反應，或者有新的微生物如自養細菌生成，可以直接降解NH4+-N. 但具體原因需要進一步去研究.
圖 3 苯酚濃度對厭氧氨氧化活性污泥形態的影響
2.4 苯酚作為有機碳源誘發體系內反硝化反應
長期實驗結果表明，當苯酚濃度大于200 mg ·L-1時，體系中NH4+-N的去除率在下降，ANAMMOX菌的能力在減弱，而NO2--N的去除率不但沒有下降反而升高，甚至達100%，說明反應體系中存在著可以降解NO2--N的反應. Toh等[24]在用ANAMMOX工藝處理焦化廢水的研究中證實了ANAMMOX體系中存在反硝化菌，而賴楊嵐等[25]研究結果進一步表明，ANAMMOX菌能與反硝化菌共存，反應器可實現ANAMMOX與反硝化的協同作用. 因此在ANAMMOX體系中加入苯酚有可能發生以苯酚為有機碳源的反硝化反應，猜測NO2--N的過量去除與苯酚有關. 本實驗中反應體系中NO2--N的減少量與苯酚的降解量如圖 4(a)所示，隨著苯酚濃度的增加，體系中苯酚的降解量在增大，而此時NO2--N的去除量也相應增大，說明NO2--N的過量去除確實是由于苯酚導致的，且苯酚作為有機碳源參與了反應，也就是反硝化反應. 當苯酚濃度高于500 mg ·L-1時，由于體系中基質(NO2--N和NO3--N)有限，所以苯酚的降解量處于平穩狀態，此時反硝化菌的能力也達到穩定.
圖 4 苯酚誘發體系內反硝化反應
劉常敬等[26] 的研究證實了此觀點，他們在研究苯酚對ANAMMOX工藝耦合反硝化時發現，在ANAMMOX體系中加入苯酚可以耦合反硝化反應，當苯酚濃度為 0.2 mmol ·L-1(18.82 mg ·L-1)時，耦合反硝化效果最好,此時消耗的NH4+-N、 NO2--N與生成的NO3--N之比為1 ∶1.52 ∶0.11，系統中NO2--N與NO3--N都相應減少. 本實驗中苯酚對NH4+-N、 NO2--N和NO3--N三者轉化比影響見圖 4(b)，當進水苯酚濃度低于100 mg ·L-1時，反應器內ρ(NO2--N)去除/ρ(NH4+-N)去除平均值為1.265，低于理論值; ρ(NO3--N)生成/ρ(NH4+-N)去除平均值為0.18，低于理論值，表明此時系統中NH4+-N轉化處于被抑制階段，這與Yang等[21]研究結果相近. 而當加入苯酚濃度大于200 mg ·L-1時，ρ(NO2--N)去除/ρ(NH4+-N)去除逐步提高至1.32并持續升高，最高時達到14.66，表明系統中出現明顯的反硝化反應，其所占比例在逐漸提高.
既然體系中存在反硝化反應，那么系統中TN的損失是由ANAMMOX反應造成的還是由反硝化反應造成的，或者說由二者共同造成的呢. 如果是二者共同的結果，那二者之間所占比例又如何. 以ANAMMOX理論計量比(1 ∶1.32 ∶0.26)計算ANAMMOX反應和反硝化反應對體系TN去除的貢獻如圖 4(c)所示. 計算說明如下.
體系進水NH4+-N為100mg ·L-1，NO2--N為130mg ·L-1，反應容積V為250 mL，進水TN為：
TN=(100+130)mg ·L-1·0.25 L
體系中NH4+-N的去除是由ANAMMOX反應引起的，因此以NH4+-N的去除量作為ANAMMOX菌的去除能力. 而ANAMMOX反應每當消耗1 mg NH4+-N時，相應會消耗1.32 mg NO2--N，同時生成0.26 mg NO3--N. 用NH4+-N去除率計算體系中NH4+-N去除量：
NH4+-N去除量=NH4+-N去除率 ·(100 mg ·L-1 ·0.25 L)
因此，ANAMMOX反應消耗體系中的TN為：
TN=NH4+-N去除率 ·100 ·(1+1.32-0.26) mg ·L-1 ·0.25 L
ANAMMOX反應對TN的貢獻(A)則為：
A=[NH4+-N去除率 ·100 ·(1+1.32-0.26) mg ·L-1 ·0.25 L] ·[(100+130)mg ·L-1 ·0.25 L]-1
反硝化對TN的貢獻(B)則為：
B=TN的去除率-ANAMMOX的貢獻
當苯酚濃度≤300 mg ·L-1時，ANAMMOX反應對TN去除占80%以上，反硝化反應對TN去除占比低于15%，體系內仍以ANAMMOX反應為主導，但ANAMMOX貢獻率在不斷降低，反硝化貢獻率在不斷增加; 當苯酚濃度達到400 mg ·L-1時，二者比例達到對等，分別為37%和36%，此時反硝化細菌開始與氨氧化細菌形成競爭局面. 隨后反硝化反應在體系中所占比例超過了ANAMMOX，當苯酚濃度為500 mg ·L-1時，出水NH4+-N繼續升高，但NO2--N和NO3--N仍為0 mg ·L-1，且苯酚的降解量處于平穩狀態，說明反硝化菌能夠利用的基質不足，導致苯酚的降解量維持在穩定階段，此時反硝化菌能力達到穩定，ANAMMOX反應和反硝化反應對氮去除分別占18%和45%，此時ANAMMOX菌受到了嚴重的抑制，體系中反硝化細菌適應了苯酚環境，并且已成為優勢菌種，TN的去除基本由反硝化實現，反硝化反應在體系中占據主導地位.
2.5 苯酚對厭氧氨氧化活性污泥的有效半抑制濃度
短期內苯酚對ANAMMOX污泥活性影響研究表明，隨著苯酚濃度的增加，ANAMMOX污泥活性受到的抑制程度在逐漸增大并達到穩定，穩定時NH4+-N的去除率低于10%. 由線性擬合計算得出苯酚對ANAMMOX活性污泥的有效半抑制濃度(IC50)為83.6 mg ·L-1. 此值低于了苯酚初始投加量100 mg ·L-1，因此實驗一開始設置的苯酚濃度范圍過于大，計算得出的IC50準確性需進行驗證. 故縮短苯酚濃度范圍，重新做了低范圍內苯酚的短期實驗. 污泥選取及方法與上一次相同，恒溫氣浴培養15 h. 其擬合曲線如圖 5所示，通過線性擬合計算得出IC50為71.57 mg ·L-1. 因此取71.57 mg ·L-1作為短期實驗的IC50.
圖 5 短期內厭氧氨氧化污泥脫氮效能隨低濃度苯酚變化的擬合曲線
由圖 2(b)可知，當苯酚濃度為300 mg ·L-1時，NH4+-N的去除率由99%降低至55%，與Pereira等[27]長期實驗研究結果相近. Yang等[28]利用活性(以N/VSS計)為(12.4±3.1) mg ·(g ·h)-1的ANAMMOX顆粒污泥研究苯酚對污泥活性影響，短期實驗得到苯酚的IC50為 678.2 mg ·L-1. 這與本實驗的結論有很大出入，分析原因可能有以下2點： ①Yang等的擬合方程采用非競爭性抑制曲線進行擬合，表明該抑制下苯酚不會參與反應，但本實驗中苯酚在體系中參與了反應; ②污泥活性不同，Yang等ANAMMOX污泥活性比本課題組高，因此其承受抑制能力較強一些.
常規焦化廢水中苯酚含量在50-2 000 mg ·L-1之間，經過脫酚處理后可低于200 mg ·L-1 [29]. 因此，采用工藝前應先測定一下廢水中苯酚含量，若含量低于200 mg ·L-1時則可直接運用ANAMMOX工藝; 或者將將ANAMMOX工藝用在脫酚后的處理工藝. 但對于高濃度含苯酚廢水，可將苯酚作為反硝化反應的有機碳源，并與馴化后的厭氧污泥進行厭氧處理工藝聯用.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。
3 結論
(1) 短期結果表明，苯酚對ANAMMOX污泥具有抑制作用，隨著苯酚濃度的增加，ANAMMOX脫氮效能逐漸降低. 當苯酚濃度大于600 mg ·L-1時，TN去除率下降并穩定在10%左右，說明抑制達到穩定狀態. 短期實驗擬合得到苯酚對ANAMMOX半抑制有效濃度(IC50)為71.57 mg ·L-1.
(2) 長期實驗表明，低濃度苯酚對ANAMMOX體系中微生物對有一個馴化的過程，當加入苯酚濃度小于100 mg ·L-1時，NH4+-N的去除率先下降，反應后都能穩定在99%以上. 當苯酚濃度大于400 mg ·L-1時，NH4+-N的去除率明顯下降，ANAMMOX污泥脫氮效能受到了嚴重抑制.
(3) 苯酚的加入誘發了ANAMMOX體系中發生反硝化，隨著苯酚濃度的增加，反硝化所占相對比例也在增大. 但高濃度苯酚(1 000 mg ·L-1)對反硝化細菌同樣具有抑制作用.
(4) 苯酚對ANAMMOX污泥抑制明顯，導致部分污泥死亡，經過18 d恢復后氮素之間的轉化計量式發生改變，ρ(NH4+-N)去除/ρ(NO2--N)去除/ρ(NO3--N)生成為1 ∶0.86 ∶0.2.（來源及作者：蘇州科技學院環境科學與工程學院 楊朋兵 李祥 黃勇 朱亮 崔劍虹 徐杉杉）
