由于抗生素廣泛用于人類醫(yī)療、 畜禽養(yǎng)殖、 水產(chǎn)養(yǎng)殖等，大量殘留的抗生素進(jìn)入環(huán)境，致使微生物在持續(xù)抗生素選擇壓力下產(chǎn)生了耐藥性，形成了耐藥菌[1]. 抗性基因是耐藥菌具有抗性的主要原因之一，它可以通過多種形式的可移動(dòng)遺傳元件如質(zhì)粒、 整合子、 轉(zhuǎn)座子、 插入序列等，突破細(xì)菌之間的種屬關(guān)系廣泛傳播，加重抗性污染[2]. 近幾年，國內(nèi)外細(xì)菌的耐藥率成逐年上升的趨勢[3, 4, 5]，并且國內(nèi)外已有報(bào)道指出，耐藥菌和抗性基因可能成為一種新型的環(huán)境污染物，其風(fēng)險(xiǎn)將比抗生素藥物本身的污染風(fēng)險(xiǎn)更高[6],這將對環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[7, 8].
大環(huán)內(nèi)酯與林可霉素、 鏈陽菌素類抗生素具有細(xì)菌染色體上重疊的作用位點(diǎn)，因此導(dǎo)致一類抗性基因?qū)λ羞@些抗生素具有抗藥性，稱為大環(huán)內(nèi)酯類-林可霉素類-鏈陽菌素(macrolide-lincosamide-streptogramin,MLS)抗性基因[9]. 已有研究表明，MLS抗性基因不僅能在G+和G-菌之間傳播[10, 11]，而且廣泛存在于污水中，例如，MLS抗性基因廣泛存在于污水處理廠和海河流域的河水[12]、 養(yǎng)豬廢水[13]和臨床醫(yī)院廢水[14]，其中在臨床醫(yī)院廢水中分離出的紅霉素耐藥鏈球菌(Streptococcus)中有78.7%攜帶MLS抗性基因[14]. MLS抗性基因宿主廣泛，且抗生素制藥廢水通常含有非常高的微生物量和豐富的營養(yǎng)，是耐藥菌、 MLS抗性基因產(chǎn)生和擴(kuò)散傳播的高發(fā)區(qū). 抗生素廢水有機(jī)物濃度高，難于處理，目前人們主要關(guān)注的是常規(guī)污染物(如COD、 氨氮)的去除效果，缺乏對抗生素廢水抗性污染控制的深入研究.
本文以江蘇無錫某螺旋霉素生產(chǎn)廢水為研究對象，通過現(xiàn)場采樣分析，重點(diǎn)考察耐藥菌(antibiotic resistance bacteria,ARB)與抗性基因(antibiotic resistance genes,ARG)在螺旋霉素抗生素廢水處理過程中的分布和轉(zhuǎn)歸特征，以期為抗生素制藥廢水的抗性污染防治提供科技支撐.
1 材料與方法
1.1 樣品采集
本研究的樣品采集于江蘇省無錫市某制藥廢水處理站，主要采用活性污泥法處理螺旋霉素生產(chǎn)廢水 ，污水處理流程為：調(diào)節(jié)池-厭氧池-缺氧池-好氧池-二沉池. 本研究采樣分兩次進(jìn)行，分別于2014年4月(春季)和2014年9月(秋季)采集不同污水處理單元(調(diào)節(jié)池、 厭氧池、 缺氧池、 二沉池)的出水樣品，分別標(biāo)記為A1～A4和S1～S4. 采集的樣品置于便攜式冰箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并于4℃冰箱中保存待用. 1.2 樣品的處理 1.2.1 水質(zhì)分析
根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)方法[15]對污水的常規(guī)指標(biāo)(SS、 COD、 氨氮、 硝酸鹽、 亞硝酸鹽、 磷酸鹽等)進(jìn)行檢測. 1.2.2 樣品總DNA提取
由于污水樣品為泥水混合物，為了使泥水能夠分離，同時(shí)又不會(huì)把水樣中的微生物沉淀下去，并考慮到泥水混合物中大顆粒物與微生物的沉降速度不同，故通過低速離心使其分離，根據(jù)各采樣點(diǎn)的水質(zhì)不同分別取20～100 mL經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾，將濾膜剪碎，采用試劑盒Fast DNA Spin Kit for soil (USA)對濾膜上截留的生物量提取基因組總DNA. 提取的DNA溶液在Nanodrop分光光度計(jì)(Nanodrop，US)上測定濃度和質(zhì)量，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(TBE緩沖液，質(zhì)量體積比1%). 1.2.3 樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌和腸球菌豐度的分析
總異養(yǎng)菌濃度的分析主要采用R2A培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)[16]，用1 mL 滅菌移液吸管吸取污水樣品1 mL，緩慢注入含有9 mL滅菌PBS緩沖液的試管內(nèi)，振蕩試管混合均勻，制成10-1 稀釋菌液. 同法依次連續(xù)稀釋至10-2、 10-3、 10-4、 10-5稀釋菌液. 每個(gè)采樣點(diǎn)水樣選擇3個(gè)適宜稀釋度，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)平行樣，吸取0.1 mL稀釋菌液，加在已經(jīng)倒入滅菌培養(yǎng)基并凝固備用的平板上. 涂布法涂布均勻，37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后計(jì)數(shù)，以上無菌操作均在超凈臺(tái)中進(jìn)行.
腸球菌的濃度分析主要采用濾膜法測定[17]，污水樣品同上經(jīng)過稀釋，不同采樣點(diǎn)的樣品采用PBS緩沖液稀釋成適宜的稀釋液，用孔徑0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾，將濾膜以截留面朝上貼附在滅菌濾膜腸球菌培養(yǎng)基并凝固備用的平板上，平板倒置于生化培養(yǎng)箱中，37℃恒溫培養(yǎng)2~5d，根據(jù)菌落生長情況確定培養(yǎng)時(shí)間(t). 計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品中腸球菌的豐度. 挑取乳白色菌落劃線于膽鹽七葉苷瓊脂培養(yǎng)基上，挑取有棕色光澤的菌落保存進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn). 1.3 菌株藥敏測試
藥敏測試采用CLSI 推薦的Kirby-Bauer 紙片法[18]，將待檢菌株菌液的濁度用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)蠞岫群螅妹藓炚喝【和坎加贛uller-Hinton 瓊脂(Oxoid)平板上，貼上4種抗生素藥敏紙片(Oxoid)：阿奇霉素(AZI)、 紅霉素(ERY)、 螺旋霉素(SP)、 克拉霉素(CLR). 將平板倒置于生化培養(yǎng)箱中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，采用CLSI 標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株的抗性，該研究以ATCC25922菌株為質(zhì)控菌株. 1.4 抗性基因和轉(zhuǎn)移元件的檢測 1.4.1 抗性基因定性和腸球菌攜帶抗性基因的檢測
采用PCR方法檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB、 ermF、 ermX、 mefA、 ereA、 mphB和轉(zhuǎn)移元件ISCR1、 intI1、 Tn916/1545，PCR所用引物見表 1. 抗性基因定性檢測反應(yīng)體系為：10 μL Green qPCR Master Mix，0.5 μL引物(F)，0.5 μL引物(R)，DNA模板1 μL，加ddH2O至20 μL. 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min; 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，34次循環(huán); 72℃ 5 min，并在4℃保存. 每次運(yùn)行使用無菌水做陰性對照，PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂凝膠電泳分析.
表 1 抗性基因和轉(zhuǎn)移元件所用引物序列
采用菌液PCR的方法檢測腸球菌攜帶抗性基因ermB、 mefA和轉(zhuǎn)移元件intI1的情況，基因引物同上. 菌液PCR反應(yīng)體系為：10 μL Green qPCR Master Mix，0.5 μL引物(F)，0.5 μL引物(R)，菌液0.5 μL，加ddH2O至20 μL. 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 15 min; 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，34次循環(huán); 72℃ 5 min，并于4℃保存. 每次運(yùn)行使用無菌水做陰性對照，PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂凝膠電泳分析. 1.4.2 抗性基因的定量檢測
采用SYBR-Green實(shí)時(shí)定量PCR方法對各基因進(jìn)行定量分析，檢測儀器為StepOne型熒光定量PCR儀(ABI，美國). PCR產(chǎn)物經(jīng)過克隆測序確認(rèn)后，使用生工質(zhì)粒提取試劑盒SK1131從陽性克隆子中提取質(zhì)粒，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線. 使用NanoDrop微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)測定質(zhì)粒濃度. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)按照10倍梯度稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒，于90 μL稀釋液中加入10 μL 質(zhì)粒，做4~6個(gè)點(diǎn)，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)選取合適標(biāo)準(zhǔn)品用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線. 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、 環(huán)境樣品、 陰性對照均做3個(gè)平行，取平均值進(jìn)行計(jì)算.
質(zhì)粒拷貝數(shù)換算公式(copies ·μL-1)=[質(zhì)粒濃度(ng ·μL-1)×10-9×6.02×1023]/[克隆產(chǎn)物堿基數(shù)×660(g ·mol-1)]
載體(pMD 18-T)堿基數(shù)=2 692 bp，載體(pGEMX-T Easy)堿基數(shù)=3 023 bp
熒光定量PCR反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×SYBR，1.0 μL DNA (10 ng ·μL-1)，0.5 μL 引物 F (10 mol ·L-1)，0.5 μL引物 R (10 mol ·L-1)，10.5 μL 水，總體積 25.0 μL. 熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋孩?50℃，2 min，② 95℃，5 min，③ 95℃，20 s，④ 退火，30 s，⑤ 72℃，31 s，⑥ Plate read，重復(fù)③~⑤,39 次重復(fù)，⑦M(jìn)elt-curve 分析：60℃ to 95℃. 每隔0.2℃采集一次熒光以生成溶解曲線，根據(jù)溶解曲線的變化檢測擴(kuò)增結(jié)果的特異性. 退火溫度和反應(yīng)時(shí)間根據(jù)引物不同進(jìn)行調(diào)整. 2 結(jié)果與討論 2.1 水質(zhì)凈化效果
從表 2可知，進(jìn)水的COD和氨氮濃度較高，經(jīng)過厭氧池、 缺氧池和好氧池之后，逐級下降，二沉池出水中COD和氨氮的濃度分別為142.5 mg ·L-1和26.1 mg ·L-1，COD和氨氮的去除率分別為90%～94%和87%～90%，基本達(dá)到了發(fā)酵類制藥工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)(GB 21903-2008)的要求.
表 2 抗生素制藥廢水處理過程的常規(guī)化學(xué)指標(biāo)
圖 1顯示了總異養(yǎng)菌和腸球菌在4個(gè)污水處理單元的去除效果. 調(diào)節(jié)池出水中總異養(yǎng)菌濃度(CFU ·100 mL-1)介于8.2~8.4 logs，腸球菌濃度(CFU ·100 mL-1)介于5.3~5.6 logs，這表明春季和秋季進(jìn)水中都有著豐富的異養(yǎng)菌和腸球菌.
圖 1 抗生素制藥廢水處理過程中總異養(yǎng)菌和腸球菌的豐度分布
以往的研究表明，污水處理過程中可以去除0~5個(gè)數(shù)量級的總異養(yǎng)菌和腸球菌[17]. 本研究表明，經(jīng)過厭氧池、 缺氧池、 好氧池處理階段后，總異養(yǎng)菌和腸球菌都大幅度地被去除，二沉池出水中總異養(yǎng)菌和腸球菌的濃度分別降低了1.6~2.1 logs和3.7 logs，有效降低了細(xì)菌抗性的傳播風(fēng)險(xiǎn). 2.2 腸球菌的耐藥率
從春季和秋季采集的4個(gè)污水生物處理單元的出水中分離出了94株腸球菌，它們對4種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥率變化情況如表 3所示，所有的腸球菌對阿奇霉素、 克拉霉素、 紅霉素和螺旋霉素都具有抗性. 然而經(jīng)過污水處理之后，腸球菌的耐藥率不僅沒有得到削減，而且在春季和秋季沒有顯著差異，這說明腸球菌的耐藥率與季節(jié)并沒有直接的相關(guān)性. Ma等[23]認(rèn)為污水生物處理能有效削減微生物量包括病原菌，但卻不能有效削減一些攜帶抗性基因和整合子的細(xì)菌. 本研究結(jié)果表明，螺旋霉素生產(chǎn)廢水生物處理能有效地削減總異養(yǎng)菌和腸球菌的數(shù)量，但卻不能削減耐藥菌的比例.
表 3 腸球菌的耐藥率
2.3 抗性基因的分布和轉(zhuǎn)歸特征
2.3.1 腸球菌攜帶抗性基因的檢出率
從4個(gè)污水生物處理單元出水中分離出來的94株腸球菌均對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素螺旋霉素、 阿奇霉素、 克拉霉素、 紅霉素具有抗性. 通過檢測這94株腸球菌抗性菌所攜帶的MLS抗性基因ermB、 mefA和轉(zhuǎn)移元件intI1，結(jié)果顯示(見表 4)，有75株腸球菌對ermB抗性基因呈陽性，但全部94株腸球菌對mefA和intI1都呈陰性. 已有研究報(bào)道ermB抗性基因的檢出率高于MLS抗性基因的檢出率[24]. 雖然Luna等[25]分離出的腸球菌攜帶抗性基因mef，但是Portillo等[26]分離的腸球菌卻沒有檢測到抗性基因mef，這與本研究的結(jié)果一致，他認(rèn)為不同環(huán)境中抗性基因mef的分布特征不同. 春季分離出的30株腸球菌中有73%攜帶抗性基因，而秋季分離出的64株腸球菌中有79%攜帶ermB抗性基因，這說明氣溫對腸球菌攜帶抗性基因沒有顯著的影響.
表 4 腸球菌攜帶抗性基因的檢測結(jié)果
在4個(gè)污水處理單元中ermB的檢出率分別為84%、 73%、 76%、 75%. ermB抗性基因在厭氧池有一定的去除效果，但在缺氧池開始出現(xiàn)了反彈. 總體來說，經(jīng)過污水處理，腸球菌中抗性基因ermB的檢出率下降了9%. ermB抗性基因常常與一些質(zhì)粒、 轉(zhuǎn)座子等轉(zhuǎn)移元件相關(guān)聯(lián)[24]，在缺氧池中出現(xiàn)反彈的原因很可能與轉(zhuǎn)座子、 質(zhì)粒的相關(guān)聯(lián)有關(guān)，然而環(huán)境中的生物千變?nèi)f化，也可能與微生物量的變化有著緊密的聯(lián)系，具體原因有待進(jìn)一步研究. 2.3.2 抗性基因的分布和轉(zhuǎn)歸特征
利用熒光定量PCR的方法檢測了大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB、 ermF、 ermX、 mefA、 ereA、 mphB和轉(zhuǎn)移元件ISCR1、 intI1、 Tn916/1545在4個(gè)污水處理單元中不同季節(jié)的分布特征和變化情況(圖 2). 從圖 2(a)中可知，春季進(jìn)水中抗性基因和轉(zhuǎn)移元件的濃度范圍為4.53×105～3.39×107 copies ·mL-1，二沉池出水中抗性基因的濃度范圍為0～7.53×106 copies ·mL-1，污水處理對抗性基因ermB、 ermF、 mefA、 ereA、 mphB和轉(zhuǎn)移元件Tn916/1545都有一定的去除效果，削減范圍為0.4～6 logs，抗性基因和轉(zhuǎn)移元件的削減效果依次為mefA>Tn916/1545> mphB> ereA> ermF>ermB，其中mefA在二沉池出水中未檢出，去除了6 logs，去除效果最好; 而ermX、 intI1、 ISCR1不但沒有被去除，反而出現(xiàn)了反彈. 如圖 2(b)中所示，秋季進(jìn)水中抗性基因和轉(zhuǎn)移元件的含量范圍為 4.17×104～2.95×107 copies ·mL-1，二沉池出水中抗性基因和轉(zhuǎn)移元件的含量范圍為1.86×103～8.19×106 copies ·mL-1，抗性基因ermB、 ermF、 mefA、 ereA、 mphB和轉(zhuǎn)移元件Tn916/1545有一定的去除效果，出水中下降了0.55～2.1 logs，其中mefA去除效果較好，下降了2.1 logs，而ermX、 intI1、 ISCR1出現(xiàn)了反彈.
圖 2 抗生素制藥廢水處理過程中抗性基因和轉(zhuǎn)移元件的變化
從上述結(jié)果可知，春季和秋季中ermB和ermF抗性基因的濃度均為最高. 已有研究證實(shí)了erm-TR抗性基因的檢出率最高，是最廣泛存在的大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因[13]. ermB和 ermF的豐度高，一個(gè)原因是宿主廣泛，已報(bào)道的研究中表明宿主覆蓋了革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)、 好氧菌和厭氧菌，另一個(gè)原因是這些基因常常與水平轉(zhuǎn)移因子有關(guān)，比如可連接的轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒. 抗性基因mefA 為外排泵基因，在春季和秋季樣品中的去除效果均是最好的. 但是廣泛的宿主和潛在的水平轉(zhuǎn)移能力與該基因在系統(tǒng)中的低濃度似乎有些矛盾. 可能解釋的原因是由于 G-菌存在外膜，螺旋霉素不能進(jìn)入 G-菌細(xì)胞，G-細(xì)菌具有固有抗性，因此不需要外排泵作用[27]. 根據(jù)水質(zhì)情況分析，春季中進(jìn)水的COD明顯比秋季進(jìn)水高，已有研究表明有機(jī)物濃度的增加利于耐藥菌和抗性基因的傳播擴(kuò)散. 本研究中春季樣品中抗性基因豐富的原因很可能與高濃度的有機(jī)污染物存在有關(guān)[28].
將各抗性基因歸一化到16S rRNA，考察抗性基因在污水處理過程中的相對豐度變化，可以了解抗性基因在總DNA中的相對表達(dá)量，結(jié)果見圖 3. 如圖 3(a)所示春季樣品在污水處理過程中抗性基因ermF、 mefA、 ereA、 mphB和轉(zhuǎn)移元件Tn916/1545的豐度分別降低了25.24%、 100%、 65.14%、 93.31%和97.90%，而抗性基因ermB、 ermX和轉(zhuǎn)移元件intI1、 ISCR1的豐度均不同程度上升了. 如圖 3(b)所示，秋季樣品在污水處理過程中抗性基因ermB、 mefA、 ereA和轉(zhuǎn)移元件Tn916/1545的豐度降低了82.73%、 93.31%、 3.97%和92.25%，而抗性基因ermF、 mphB、 ermX和轉(zhuǎn)移元件intI1、 ISCR1的豐度均不同程度上升了.
圖 3 各污水樣品中 MLS 抗性基因和轉(zhuǎn)移因子的相對豐度
污水處理過程中只可以去除部分抗性基因和轉(zhuǎn)移元件，但同時(shí)也使部分抗性基因發(fā)生了傳播. mefA、 ereA、 Tn916/1545的豐度在春季和秋季樣品中有顯著的差異，這些抗性基因和轉(zhuǎn)移元件在春季樣品中的去除效果明顯好于秋季. 目前，抗性基因在何種環(huán)境和條件下會(huì)水平轉(zhuǎn)移，在何種情況下會(huì)削減尚無一致定論，還有待今后更深入地研究. 具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3 結(jié)論
(1)螺旋霉素制藥廢水生物處理(厭氧-缺氧-好氧)能有效削減總異養(yǎng)菌和病原菌腸球菌的數(shù)量，總異養(yǎng)菌和腸球菌的濃度分別降低了1.6~2.1 logs和3.7 logs.
(2)分離出來的94株腸球菌均對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素螺旋霉素、 阿奇霉素、 克拉霉素、 紅霉素具有抗性. 雖然污水處理對腸球菌的耐藥率沒有削減作用，但經(jīng)過污水處理后腸球菌中ermB的檢出率下降了9%.
(3)抗生素制藥廢水生物處理對抗性基因ermB、 ermF、 mefA、 ereA和轉(zhuǎn)移元件Tn916/1545的含量有一定的削減作用，但抗性基因ermX和intI1、 ISCR1的含量反而發(fā)生了一定程度的反彈.
(4)抗生素制藥廢水生物處理過程中mefA、 ereA、 Tn916/1545的豐度降低了，且春季mefA、 ereA、 Tn916/1545的去除效果明顯好于秋季，而ermX和轉(zhuǎn)移元件intI1、 ISCR1的豐度分別增加了。(來源及作者：廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 覃彩霞、申佩弘 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 佟娟、魏源送)
