1 引言

　　近年來, 隨著紡織印染工業的發展, 我國染料產量日益增長.其中, 蒽醌染料具有結構穩定、易于合成和顏色亮麗等良好性能, 作為高端染料呈現出良好的發展勢頭.1-氨基蒽醌-2-磺酸(ASA-2)不僅是一種合成蒽醌染料的中間體, 而且可經過溴化合成重要的蒽醌染料中間體溴氨酸, 其水溶液色彩鮮艷.高產能下, 蒽醌染料及其中間體在生產、合成和使用過程中有相當比重直接被排放到環境中, 成為工業廢水的重要污染源.在我國淡水資源短缺、水體污染加劇和環境問題凸顯的大背景下, 蒽醌染料及其中間體的無害化處理受到了廣泛關注.生物方法因其能耗小、二次污染少和環境友好等優點而被廣泛采用.已報道許多微生物如Bacillus benzeovorans、Rhodopseudomonas XL-1、Citrobacter sp. C-7和Pichia pastoris SMD1168H能夠降解蒽醌染料及其中間體.然而工業廢水體系復雜, 含多種復合成分, 如多種蒽醌類化合物及其中間體共存, 高鹽, 有一定的酸堿度等, 這些都給降解菌株的底物廣譜性及惡劣環境耐受性提出了新的挑戰.因此, 篩選出高效、廣譜性且能夠適應工業廢水復雜環境條件的降解菌株對工業蒽醌染料廢水處理尤為重要.

　　近年來, 嗜吡啶紅球菌憑借其對難降解污染物獨特的降解能力受到了許多學者的關注, 成為一類具有潛力的新型微生物資源.已有文獻報道, 嗜吡啶紅球菌可以降解多氯聯苯、石油充氧劑甲基叔丁醚、內分泌干擾物玉米烯酮和4-硝基甲苯等多種環境污染物.可見, 嗜吡啶紅球菌在污染物治理方面有著巨大潛力, 但尚未有關于蒽醌染料及中間體降解方面的報道.

　　本實驗室從受溴氨酸污染的泥土中篩選分離出一株新的蒽醌染料中間體1-氨基蒽醌-2-磺酸(縮寫為ASA-2)降解菌, 通過形態學觀察和16S rDNA序列分析, 鑒定其為嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinovorans).以ASA-2為模式污染物, 研究了菌株GF3對其生物脫色的特性, 并鑒定了ASA-2降解的終產物.此外, 研究發現該菌株還能夠降解溴氨酸、蒽醌-2-磺酸鈉和蒽醌-2-羧基等蒽醌化合物.

　　2 材料和方法

　　2.1 實驗材料

　　菌株分離所用的泥土樣品取自國內浙江臺州某染料工廠排污口溴氨酸污染的泥土.1-氨基蒽醌-2-磺酸(縮寫為ASA-2)由大連理工大學實驗室提供, 分子量為303, 配置成5.0 g·L-1的ASA-2母液待用.氨基酸購買于Solarbio公司;甲醇、乙酸和三乙胺為高效液相色譜純;其他試劑均為國產分析純.

　　2.2 培養基

　　富集培養基：蛋白胨10.0 g·L-1, 酵母膏5.0 g·L-1, NaCl 10.0 g·L-1(pH 7.2).

　　無機鹽培養基：KH2PO40.5 g·L-1, Na2HPO4·12H2O 0.82 g·L-1, 0.002 5 g·L-1 FeCl3(pH 7.0).

　　2.3 實驗方法

　　2.3.1 菌株的篩選

　　將10 g污泥樣品投加到200 mL富集培養基(含50 mg·L-1的ASA-2)中培養后, 取培養液接入漸減的富集培養基(酵母膏和蛋白胨含量是上一個培養基的一半)中馴化, 當培養基中ASA-2完全褪色后轉接到下一個培養基內, 接種量為10%(體積比).經過大約40 d的馴化培養, 反復不斷平板涂布, 最后選出1株具有較強降解能力的菌株(命名為GF3), 保存在15%甘油水溶液中置于-80 ℃冰箱.

　　2.3.2 菌體形態及16S rDNA測序

　　用掃描電鏡(SU80IO, Japan Hitachi)觀察菌株GF3的外觀形態, 放大倍數為10000倍.16S rDNA的測序工作由大連寶生物公司完成, 將測得的序列用BLAST軟件與GenBank中已知的16S rDNA序列進行同源性比較.

　　2.3.3 菌體生長量與ASA-2濃度的測定

　　菌體干重X(g·L-1)與菌液濁度(OD660nm)存在線性關系, 經實驗得OD660nm=4.009 7 X + 0.0553(R2=0.9872).測量樣品溶液在660 nm下的吸光度, 然后根據上述公式轉換成菌體干重濃度.ASA-2濃度C(mg·L-1)測定采用分光光度計(JASCO UV-560, Japan)法, 即從ASA-2脫色體系取菌液在10000 r·min-1下離心5 min, 取上清液在ASA-2特征吸收波長處(475 nm)測量其吸光度, 根據ASA-2濃度標準曲線C=55.189 OD475 nm-0.7637(R2=0.9990)換算為濃度.ASA-2脫色率的計算公式：

　　(1)

　　式中, C0和Ct分別表示初始時刻和t時刻底物的濃度(mg·L-1).

　　表 1 外加營養物質的組成

　　2.4 脫色條件優化

　　將保藏在-80 ℃冰箱中的菌種接入20 mL無機鹽培養基(含0.6 g·L-1酵母膏, 20 mg·L-1ASA-2)中, 于30 ℃、150 r·min-1培養至ASA-2完全脫色后, 按2%(體積比)的接種量將菌液接入50 mL無機鹽培養基(含2.0 g·L-1酵母膏, 50 mg·L-1 ASA-2)中擴大培養.當ASA-2完全脫色時, 離心(10000 r·min-1, 10 min, 4 ℃), 并用磷酸緩沖溶液(20 mmol·L-1, pH=7.0)洗滌3次, 棄上清液, 重懸于10 mL磷酸鹽緩沖溶液中.將制備的GF3菌懸液接入到不同的反應體系中, 考察不同外加營養物質、pH(5~10)、溫度(20~40 ℃)和轉速(0~250 r·min-1)對ASA-2脫色的影響.外加營養物質成分如表 1所示, 其中將氨基酸按照Sørensen′s方法分為A1、A2、A3、A4, 共4組.

　　2.5 ASA-2脫色產物分析

　　最適條件下, 將菌株GF3接入含有100 mg·L-1的ASA-2的無機鹽培養基中, 定時取樣, 測定不同時刻生物量和ASA-2濃度, 并進行紫外-可見波譜掃描.同時, 取100 mg·L-1 ASA-2降解過程中樣品, 在10000 r·min-1, 4 ℃下離心(AvantiTM J-30 I, Beckman, USA)分離10 min, 取上清液過0.22 μm濾膜, 進行TOC(Multi N/C 2100S, Germany Jena)和高效液相色譜-質譜分析(HP1100 LC/MSD, Agilent, USA).

　　高效液相色譜(HPLC)分析條件：流動相超純水和甲醇(體積比)：

　　, UV檢測276 nm.色譜柱為Sino Chrom ODS-BP(內徑5 μm, 尺寸4.6 mm × 250 mm), 進樣量10 μL, 流速1.0 mL·min-1, 柱溫為40 ℃.

　　高效液相色譜-質譜聯用分析條件：流動相甲醇和超純水(含0.2%的乙酸和三乙胺), 甲醇體積分數2%, 流速0.2 mL·min-1, 直接質譜進樣10 μL.電離方式ES-API(負模式), 檢測模式Full scan(50~600 amu), 電離電壓20 psig, 離子源溫度350 ℃, 去溶劑氣流量6.0 L·min-1.

　　2.6 菌株GF3降解底物廣譜性

　　最適條件下, 在外加20 mg·L-1的L-亮氨酸的無機鹽培養基中, 加入不同的蒽醌化合物, 定時從反應體系取樣, 測定蒽醌化合物的濃度變化.考察菌株GF3對其他蒽醌化合物的降解情況, 初步探索其降解底物廣譜性.

　　3 結果與討論

　　3.1 ASA-2脫色菌的分離與鑒定

　　經過多次傳代馴化、反復平板涂布, 分離純化得到一株能夠有效脫色ASA-2的菌株, 命名為GF3.固體培養基上, 菌株GF3形成的菌落較小, 邊緣整齊, 呈圓形、淡紅色.掃描電鏡觀察結果如圖 1所示, GF3為球狀或短桿狀、無鞭毛, 大小約6~12 μm.該菌株對ASA-2有很強的脫色能力, 隨著培養時間的延長, ASA-2原有的紅色逐漸褪去, 最后完全消失.

　　圖 1好氧培養菌株GF3的形態(×10000)

　　測定菌株GF3的16S rDNA序列, 并與GenBank數據庫中的序列比對, 結果顯示菌株GF3和Rhodococcus pyridinivorans(NR025033、KF381498)的16S rDNA序列相似性達到100%.因此, 該菌株鑒定為嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans).將菌株序列提交至GenBank庫中, 獲得基因登錄序列號為KF953541.

　　3.2 脫色條件優化3.2.1 外加營養物質對ASA-2生物脫色的影響

　　菌株GF3能夠使ASA-2脫色, 但不能以它為唯一碳源生長.Fan等曾報道外加碳源如葡萄糖可提高鞘氨醇單胞菌FL對溴氨酸的脫色率.基于此, 本文研究了外加營養物質酵母膏、蛋白胨、水解酪蛋白、葡萄糖和維生素混合物對ASA-2脫色的影響.實驗結果如圖 2所示, 在22 h內, 外加蛋白胨、酵母膏和水解酪蛋白的反應體系中ASA-2脫色率依次達到90%、81%和58%, 而外加葡萄糖和維生素混合物體系的脫色率與對照組相似, 僅為30%左右.可見, 蛋白胨、酵母膏和水解酪蛋白對ASA-2脫色有明顯促進作用.

　　圖 2外加營養物質對ASA-2脫色的影響

　　同時, 含有這3種營養物質的反應體系中生物量也分別增長了29、61和53 mg·L-1.雖然酵母膏和水解酪蛋白體系中菌株GF3的生物量都明顯高于蛋白胨體系, 但是ASA-2脫色率達到最高的卻是外加蛋白胨體系.Dong等曾報道蛋白胨可刺激紅環菌Rhodocyclus gelatinosus XL-1對蒽醌類化合物活性艷藍KN-R的生物降解, 進而縮短降解所需的時間.推測蛋白胨中的營養成分可能提高了菌株的脫色活性.

　　3.2.2 不同氨基酸對ASA-2脫色的影響

　　蛋白胨的主要成分是氨基酸, 水解酪蛋白是酪蛋白經酸水解后形成的氨基酸混合物, 酵母膏中也含有一些氨基酸, 因此推測氨基酸可能在加速ASA-2生物脫色過程中起到了重要作用.已有相關文獻報道一些氨基酸能夠加速特定污染物的生物降解.Ronen等在研究Achromobacter piechaudii TBPZ降解2, 4, 6-三溴苯酚過程中, 發現色氨酸和苯丙氨酸的加入大大提高了菌株TBPZ生物降解活性, 進而加速了2, 4, 6-三溴苯酚的生物降解.Wu等曾報道, 氨基酸是加速伯克氏菌Burkholderia sp. GS3C對十六烷生物降解的主要影響因素.鑒于此, 考察了4組氨基酸混合物(A1、A2、A3、A4, 見表 1)對ASA-2脫色的影響, 結果如圖 3a所示.

　　圖 3外加氨基酸對ASA-2脫色的影響(A.氨基酸組合;B. A1中單個氨基酸)

　　4組氨基酸混合物均對菌株GF3脫色ASA-2有明顯促進作用, 其促進作用與500 mg·L-1蛋白棟相當或者更優.A1、A2和A4的添加使ASA-2脫色率分別提高至94%、93%和99% (空白對照組22 h后ASA-2脫色率為35%).同時, 菌株GF3的細胞濃度依次增長了36、21和16 mg·L-1.可見, A1比其它實驗組能夠更好地促進菌株GF3的細胞增殖.因此, 對A1中單個氨基酸的影響分別進行了研究, 結果如圖 3b所示.

　　A1中5種氨基酸均能在促進ASA-2脫色的同時促進菌株GF3自身細胞增殖.除了L-賴氨酸, 其它4種氨基酸體系ASA-2脫色率均達93%以上, 且與蛋白胨的促進效果相當.并且這4種氨基酸也能較好地促進細胞增殖.這種現象表明, 這4種氨基酸一方面可能是合成相關脫色酶的原料, 另一方面這些氨基酸可能通過促進細胞的增殖來促進ASA-2脫色.據報道, 鞘氨醇單胞菌降解溴氨酸和ASA-2的過程中, 只有脯氨酸的促進效果與蛋白胨相似, 并且發現脯氨酸與脫色酶活性密切相關.Ronen和Wu也曾報道少數氨基酸可加速難降解物質的生物降解, 但單獨氨基酸的促進作用都小于混合氨基酸的促進作用.然而本實驗A1組的L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸的添加對ASA-2脫色的促進效果均與這4種氨基酸混合物的促進效果相當, 不過細胞生長量是明顯低于這4種氨基酸混合物體系.可見, 過多氨基酸的添加也僅僅是促進了細胞更好的生長.

　　3.2.3 環境因素對ASA-2脫色的影響

　　pH、溫度和溶解氧是影響微生物生存與生長以及對污染物降解的重要因素.在外加20 mg·L-1亮氨酸作為共代謝碳源的條件下, 考察了不同pH、溫度和搖床轉速對菌株GF3脫色ASA-2的影響.實驗結果如圖 4所示.

　　圖 4不同環境因子對ASA-2脫色的影響

　　當培養基初始pH在7.0~8.5之間時, ASA-2的脫色率最高, 達90%以上.其中pH為8.0時, 反應體系中細胞濃度最高.當初始pH值在8.5~9.0范圍內菌株GF3仍然生長良好, 一方面表明該菌株對偏堿環境具有較強的適應能力, 另一方面也可能是因為ASA-2脫色過程中產生了偏酸性產物造成.在測定的20~40 ℃范圍內, ASA-2脫色的最適宜溫度為30 ℃, 脫色率達到95%, 菌株GF3細胞濃度也達到最高.過高或過低的溫度, 都使ASA-2脫色率和細胞生長量明顯下降.ASA-2脫色的適宜轉速范圍在150~200 r·min-1之間, 此時ASA-2脫色率達90%以上, 菌株GF3生長也最好.綜合考慮環境因素影響的實驗結果, ASA-2脫色的適宜環境條件為pH 8.0、30 ℃和150 r·min-1.

　　3.3 菌株GF3脫色ASA-2的產物分析3.3.1 ASA-2的生物脫色過程

　　最適條件下, 研究了ASA-2的生物脫色過程, 實驗結果如圖 5所示.反應開始6 h內, ASA-2的脫色率只有3%, 含有ASA-2和亮氨酸體系的細胞生長速率和只含有亮氨酸體系的細胞生長速率基本一致.可見, 這期間主要是亮氨酸促進了細胞的生長繁殖.6 h后, ASA-2開始快速脫色, 菌株GF3快速增長, 到30 h ASA-2脫色率已經達95%以上, 此時細胞濃度增加到49 mg·L-1(0 h為20 mg·L-1), 并且明顯高于只有亮氨酸作為碳源的對照體系.由此推測菌株GF3可能利用了ASA-2的脫色產物來生長.在隨后30~33 h內, ASA-2脫色率不變, 細胞略有增長, 推測這一階段細胞也是利用中間代謝產物進行生長.

　　圖 5 ASA-2脫色過程曲線

　　取脫色過程中的樣品, 稀釋5倍進行紫外-可見波譜分析, 結果如圖 6所示.隨著反應的進行, ASA-2在紫外光區227、248 nm處和可見光區475 nm處的特征吸收峰逐漸減弱, 最終完全消失, 這與反應液的顏色由紅色漸變為無色相一致.由此推斷ASA-2蒽醌環結構被破壞, 發色基團發生明顯變化.同時在340 nm處逐漸產生了新的特征吸收峰, 峰值逐漸增大.并且, 在475 nm處的特征吸收峰完全消失時, 340 nm處的峰值達到最大.這一現象說明, 在ASA-2的脫色過程中有產物生成, 且不能夠被菌株GF3利用.

　　圖 6 ASA-2脫色過程的紫外-可見波譜

　　與鞘氨醇單胞菌QYY脫色ASA-2不同, 本實驗在340 nm處產生了新的特征吸收峰, 且吸收峰強度達最大后不再減弱.而菌株QYY脫色ASA-2過程中是在375 nm處出現了新峰, 并且隨著脫色時間的推移, 375 nm處的吸收峰逐漸減弱.因此推測菌株GF3和QYY在對ASA-2的脫色過程中, 蒽醌環斷裂的方式可能不同, 導致最終降解產物也不相同, ASA-2被菌株GF3脫色后生成新的化合物.

　　實驗進一步測定了108 mg·L-1 ASA-2脫色過程中總有機碳TOC(扣除了L-亮氨酸的TOC值)的變化.在培養36 h的過程中, 總有機碳由最初的53 mg·L-1, 逐漸減少為20 mg·L-1, 總有機碳降低了約62%.并且隨著反應時間的推移, 總有機碳不再變化.可見, 菌株GF3只利用了部分有機碳, 并未將ASA-2完全礦化.

　　3.3.2 ASA-2脫色產物分析

　　對ASA-2完全脫色后的樣品進行液相色譜-質譜分析, 實驗結果如圖 7所示, ASA-2脫色終產物質荷比為260, 初步推測產物為3-氨基-4-磺酸基鄰苯二甲酸.這與菌株QYY降解ASA-2的終產物不同.并由此推測菌株GF3裂解蒽醌環的方式與以往文獻報道的蒽醌環裂解方式不同.可見, 菌株GF3通過一種新的降解途徑將ASA-2降解.

　　圖 7 ASA-2降解終產物的液相-質譜圖

　　3.3.3 菌株GF3降解底物廣譜性

　　在外加20 mg·L-1的L-亮氨酸的無機鹽培養基中, 加入不同的蒽醌化合物, 定時從反應體系取樣, 測定蒽醌化合物的濃度變化.實驗結果顯示, 除了1-氨基蒽醌-2-磺酸外, 菌株GF3還能夠降解100 mg·L-1的溴氨酸、蒽醌-2-磺酸鈉和蒽醌-2-羧酸, 使它們的降解率分別達到90%、99%和94%.但是, 菌株GF3不能夠降解蒽醌-2, 6-二磺酸鈉、活性艷藍KN-R和茜素紅.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

　　4 結論

　　1)新分離出一株1-氨基蒽醌-2-磺酸降解菌株, 鑒定為嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinivorans).

　　2)蛋白胨、酵母膏、水解酪蛋白可加速菌株GF3脫色ASA-2, 其中蛋白胨促進效果最好.單個氨基酸中L-亮氨酸對ASA-2生物脫色的促進效果最好, 同時能顯著促進菌株GF3的細胞增殖.ASA-2生物脫色的最適環境條件為：pH 8.0、30 ℃和150 r·min-1.30 h內菌株可使108 mg·L-1 ASA-2降解率達95%, 總有機碳去除率62%.

　　3)菌株GF3能夠使ASA-2的蒽醌環裂解, 終產物為3-氨基-4-磺酸基鄰苯二甲酸.菌株GF3不僅能降解1-氨基蒽醌-2-磺酸, 還能夠降解溴氨酸、蒽醌-2-磺酸鈉和蒽醌-2-羧酸.但是菌株GF3不能夠降解蒽醌-2, 6-二磺酸鈉、活性艷藍KN-R和茜素紅.