1 引言

　　氨氧化過程是硝化反應的第一步，也是氨氮去除的限速步驟，在以往的研究中認為氨氧化細菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria，AOB)是氨氧化過程中的唯一貢獻者，新近研究發現氨氧化古菌(Ammonia-Oxidizing Archaea，AOA)也是氨氧化過程的一個重要參與者，且已在海洋、自然濕地、溫泉中檢測到了氨氧化古菌的大量存在.氨氧化古菌的出現促使人們更新了對氮循環的認識.近幾年來，地表水受點源與面源污染的影響，使很多水源地水質呈現微污染狀態，其中氨氮是主要污染物之一.人工濕地是一種對氮、磷污染物去除率高、處理工藝簡單、生態修復能力強的處理系統，是解決水源地微污染問題的有效途徑.目前，很多專家致力于對人工濕地中氨氧化微生物的研究，Wang和Gu(2013)發現在低氨氮環境中人工濕地中氨氧化古菌豐度及生物多樣性要高于自然濕地.且很多研究表明氨氧化細菌在低溫條件下生長會受到明顯抑制，而氨氧化古菌具有較高豐度，比氨氧化細菌更具有競爭力.國內對人工濕地的研究已有大量報道，而對低溫條件下濕地系統中的微生物特性報道較少.因此，研究人工濕地在低溫環境下微生物作用機制及提高濕地系統對氨氮的處理效率具有重要意義.

　　本文針對寒冷冬季北方氨氮微污染水體的特征，構建間歇流人工濕地系統在低溫條件下運行，研究不同運行條件下對氨氮的去除效率，并運用分子生物技術對各運行條件下氨氧化古菌和氨氧化細菌進行定性定量分析，同時對濕地系統中氨氧化微生物的比細胞速率和土壤的硝化速率潛勢進行考察，并對夏季和冬季樣品中的氨氧化古菌的生物多樣性季節性變化進行討論，以期為提高在低溫條件下濕地系統對氨氮的去除效率提供理論依據.

　　2 材料和方法

　　2.1 人工濕地系統構建

　　構建容積為0.5 m3(寬0.5 m×長1 m ×高1 m)的垂直流人工濕地4塊(如圖 1)，均在底部鋪設20 cm的碎石(直徑1~3 cm)，上層0~20 cm和50~80 cm鋪設混合土壤，其中混合土壤包含45%的粘土，25%的沙土和30%的黑土.為了增加濕地中的微生物量，在距表層30~50 cm填埋污水處理廠活性污泥，活性污泥取自北京市某城市污水活性污泥處理廠的好氧池泥水混合液，填料區總容積為0.45 m3.濕地平均孔隙率20%，含水率為18.2%，土壤容重為1.36 g · cm-3. 在濕地表層、-50 cm和底層 -70 cm處采用穿孔管均勻布水.濕地種植蘆葦，種植密度為16 株· m-2.

　　圖 1 濕地構建圖

　　本實驗采用中國科學院生態環境研究中心園區污水處理站中水，進水指標見表 1.

表1 進水水質

　　人工濕地進水與出水均采用蠕動泵精確控制，人工濕地自6月開始運行，夏季運行時，采用表層布管進水;冬季平均氣溫為5 ℃時，采用表層布水管進水;平均氣溫為-5 ℃時，由于濕地所在地區凍土深度小于50 cm，為防止表層進水結冰，采用中間布管均勻進水，出水均由蠕動泵由-70 cm處布水管抽出，考察在不同的水力負荷和停留時間下濕地的氨氮去除效率.每改變一次運行條件，連續運行一周后開始取水樣，以保證出水穩定，出水氨氮由出水管取樣檢測，每改變一次運行條件，運行34 d后用土鉆獲取濕地-50 cm處土壤樣品，取出后迅速保存于-4 ℃冰箱，取一部分土壤樣品在24 h之內測定濕地土壤硝化反應潛勢，另一部分采用冷凍干燥機(博醫康實驗儀器公司，北京)凍干，保存于-80 ℃待提取DNA.運用分子生物學技術對濕地氨氧化古菌、細菌豐度及古菌生物多樣性進行分析.

　　2.2 樣品理化指標分析

　　試驗檢測的主要水質指標測定方法如下：NH+4-N采用靛酚藍比色法，NO-3-N采用紫外分光光度法，NO-2-N采用N-(1- 萘基)-乙二胺光度法，COD采用分光光度法，TP采用過硫酸鉀消解-紫外分光光度法，pH采用PB-10型數顯pH計檢測.

　　2.3 DNA提取和聚合酶鏈式反應(PCR)

　　利用Fast Soil DNA提取試劑盒(Qbiogene，Carlsbad，CA)，從約0.33 g凍干土壤樣品中提取土壤中的總DNA，所得土壤DNA于-20 ℃保存待用.氨氧化古菌擴增采用amoA功能基因的特異引物，分別為archaea-amoAF/archaea-amoAR.PCR反應體系為50 μL，其中，10×buffer 5 μL，2.5 mol · L-1 dNTP 4 μL，10 mmol · L-1 正反向引物各1 μL，BSA 0.25 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補足至50 μL.PCR擴增程序由以下3步構成：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，53 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環;75 ℃延伸15 min.

　　2.4 克隆文庫構建和序列分析

　　PCR擴增產物用Promega Agarose Gel DNA(Promega，Madison，WI)純化試劑盒進行切膠純化，回收的PCR產物與pGEM-Teasy載體(Promega，Madison，WI)連接，轉入JM109(TaKaRa)感受態細胞，最后進行藍白斑篩選.對選取的96 個白色克隆進行PCR擴增，以鑒定陽性克隆，所用引物為載體通用引物T7、SP6.用限制性內切酶Hha I對陽性克隆PCR擴增產物進行酶切分型，每個酶切類型挑取代表菌株進行測序(Tsingke生物技術有限公司，北京).返回序列在GenBank數據庫中進行BLAST比對，并搜索相似序列，并與已發表的相關古菌的amoA 功能基因序列進行多重序列比對，使用MEGA4.1軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹.獨立操作單元OTU利用DOTUR軟件按97%的相似度進行劃分，并計算生物豐富度和多樣性指數.

　　2.5 AOA和AOB豐度測定

　　采用實時熒光定量PCR方法分別對AOA、AOB進行定量分析，其定量PCR均采用SYBR Green法.AOA定量所用引物參見AOA普通PCR擴增，AOB定量選用amoA功能基因特異引物amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′).擴增體系為20 μL，其中，SYBRs Premix Ex Taq酶(TAKARA，大連)10 μL，ROX50 0.4 μL，濃度為200 nmol · L-1 的AOA、AOB正反向引物各0.2 μL，稀釋10倍的DNA模板2 μL，用ddH2O補足至20 μL.采用ABI 7300 Real-Time PCR System擴增儀(Applied Biosystems，CA，USA)進行定量，AOA定量PCR擴增程序如下：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環;72 ℃延伸1 min.AOB定量PCR擴增程序如下：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環;72 ℃延伸1 min.實驗設置陰性對照，并將已知拷貝數的質粒DNA梯度稀釋(10倍)，得到6個標準樣品同樣進行定量擴增，得到標準曲線，每個樣品做3次平行.要求結果擴增效率大于95%，可決系數R2大于0.98，溶解曲線為單一峰.

　　2.6 硝化速率潛勢(PNR)測定

　　硝化速率潛勢(Potential Nitrification Rate，PNR)測定(以N計)參照Kurola等(2005)的氯酸鹽抑制法，向50 mL離心管中加入3.0 g新鮮土壤樣品和20 mL磷酸鹽緩沖溶液(NaCl 8.0 g · L-1，KCl 0.2 g · L-1，Na2HPO4 0.2 g · L-1，NaH2PO4 0.2 g · L-1，pH=7.4)，以及1 mmol · L-1(NH4)2SO4.另外，加入氯酸鉀至終濃度為10 mg · L-1以抑制亞硝酸鹽氧化.溶液混勻后在室溫下避光培養24 h，加入2 mol · L-1的KCl 5 mL浸提亞硝酸鹽，離心后取上清液用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法在540 nm處測定亞硝酸鹽濃度.亞硝酸鹽累積速率即為硝化速率潛勢.所有樣品設置3個重復.

　　3 結果

　　3.1 不同水力負荷下人工濕地的運行情況

　　夏季運行時，人工濕地采用停留時間48 h，水力負荷4.2 cm · d-1運行，氨氮去除效率達98%~99%，穩定運行2個月后取土壤樣品提取DNA，對氨氧化古菌和氨氧化細菌中amoA基因進行定量.

　　繼進入冬季后平均氣溫降為5 ℃，采用停留時間為21 h，不同水力負荷(4.2 cm · d-1，4.8 cm · d-1，5.4 cm · d-1，6 cm · d-1)運行，平均每6 d取1次水樣對氨氮濃度進行檢測，各人工濕地氨氮去除率都達到98%以上(如圖 2).在人工濕地運行34 d后取土壤樣品提取DNA，采用實時熒光定量PCR技術對氨氧化古菌和氨氧化細菌中amoA基因豐度進行定量分析.在不同水力負荷條件下，各濕地中古菌和細菌中的 amoA基因豐度值同冬季低溫運行前夏季樣品相比都發生了變化.在水力負荷為4.2 cm · d-1和4.8 cm · d-1時，冬季樣品古菌(AOA)amoA基因的豐度均高于冬季前樣品，且在水力負荷為4.2cm · d-1時，古菌amoA基因豐度最高，與冬季前樣品相比增長了5.24倍;而細菌(AOB)amoA基因豐度在水力負荷為4.8 cm · d-1、5.4 cm · d-1時運行后豐度高于運行前，且在水力負荷為4.8 cm · d-1時，細菌(AOB)amoA基因豐度最高，與冬季運行前樣品相比增長了6.50倍.

　　圖 2 不同水力負荷下濕地中AOA、AOB中amoA基因豐度及PNR(圖中數值為冬季5 ℃與冬季前AOA和AOB比值)

　　本研究還對土壤的硝化速率潛勢進行了測定，當AOA豐度達到最高值8.87×109 copies · g-1，PNR 也為最高值16.01 nmol · g-1 · h-1(以N計)，PNR的變化趨勢和AOA豐度呈正相關，且AOA高于AOB的amoA基因豐度的6.6~33.2倍，這說明在低溫條件下，AOA對氨態氮的氧化具有較高的競爭優勢.

　　3.2 不同停留時間人工濕地的運行

　　在運行平均氣溫降為-5 ℃時，采用水力負荷為3.6 cm · d-1，不同停留時間(21 h、18 h、12 h)運行，隨著溫度降低，人工濕地對氨氮的去除率呈下降趨勢，停留時間為21 h時，平均去除率最高達81%，停留時間縮短，氨氮去除率也明顯下降，當停留時間為18 h、12 h時，去除率分別為71%、46%.可以得出，在低溫條件下較長的停留時間有利于氨氮的去除.由圖 3可知，氨氧化古菌和氨氧化細菌中amoA基因豐度隨溫度降低而減少，但古菌AOA豐度仍高于細菌AOB豐度 2.9~32.8倍.土壤中的硝化速率潛勢沒有降低，在停留時間18 h時最低，為10.8 nmol · g-1 · h-1(以N計)，停留時間最短12 h時最高，為14.6 nmol · g-1 · h-1(以N計)，且PNR與AOA豐度及AOA/AOB的比值都呈正向變化趨勢.

　　圖 3 不同停留時間濕地系統中AOA、AOB中amoA基因豐度及PNR(圖中數值-5 ℃運行前與-5 ℃運行后AOA、AOB比值)

　　3.3 人工濕地系統中AOA的多樣性

　　為研究人工濕地中古菌AOA的生物多樣性季節性變化，取夏季土壤樣品和冬季平均氣溫為-5 ℃運行時土壤樣品提取DNA，進行特異性擴增，得到片段長度約為636 bp的AOA擴增產物，進行克隆，每個樣品進行隨機挑取96個克隆子，對其陽性進行酶切，夏季樣品得到11種酶切類型，冬季樣品得到15種酶切類型，每種類型挑取一個樣品，進行測序，通過OTU計算，將相似性為97%以上的序列分為1個OTU，濕地系統中氨氧化古菌生物多樣性情況如表 2所示.夏季樣品與冬季樣品序列放在一起計算OTU，共得到21個OTU，其中夏季樣品分為8個OTU，冬季樣品分為13個OTU，且夏季樣品和冬季樣品序列無相近序列劃分為1個OTU.用混亂度估計值的方法對文庫的物種豐富度進行估算，冬季樣品指數為31.33高于夏季樣品指數10.50;通過計算香農指數及辛普森優勢度指數倒數來分析細菌的多樣性，冬季樣品都高于夏季樣品，因此，可以得出冬季樣品的物種豐富度和生物多樣性都高于夏季樣品.

表2 濕地系統中氨氧化古菌的生物多樣性

　　對人工濕地夏季和冬季樣品OTU代表序列和GenBank數據庫中的相近序列建立系統發育樹如圖 4 所示.其中，人工濕地中古菌AOA amoA基因序列的分類操作單元夏季樣品以OTU-S開頭表示，冬季樣品以OTU-W開頭表示.由圖可知人工濕地土壤中古菌amoA基因序列在系統發育樹中分成了兩大支系，土壤支系和海洋水體支系.而土壤支系中的Nitrososphaera gargensis、Nitrososphaera viennensis EN76及C and idatus Nitrosocaldus yellowstonii，海洋支系中的Nitrosotale adevanaterra、Cenarchaeum symbiosum A、Nitrosopumilus sp. NM25和Nitrosopumilus maritimus SCM1均已被劃入一個新的古菌類群—奇古菌門(Thaumarchaeota)，所以濕地系統土壤中的氨氧化古菌均屬于奇古菌門.

　　圖 4 依據amoA功能基因序列構建的氨氧化古菌系統發育樹

　　濕地系統在低溫條件下間歇運行后，土壤多樣性發生了變化，可看出明顯的季節性差異.其中夏季樣品全部屬于土壤支系，75%的序列(5個OTU)與中度嗜溫菌C and idatu Nitrososphaera gargensis相似度較高.而冬季樣品各個OTU差異度較高，其中11個OTU屬于土壤支系，土壤支系中OTU-W8#和OTU-W12#與中度嗜溫菌C and idatu Nitrososphaera gargensis相似度達89%和92%，OTU-W7#與Nitrososphaera viennensis EN76相似度達89%，同時還產生很多新的支系，可能屬于一些還未被定義的新古菌;還2個OTU屬于海洋水體支系，其中OTU-W11#與來自根際土壤的Nitrosoarchaeum koreensis MY1相似度高達95%，OTU-W11#和OTU-W13#和來自海洋的Nitrosopumilus maritimus相似度達90%和81%.

　　本文中的參比序列來自GenBank數據庫，括號中字母和數字為序列提交序號.分支節點上的數字為每1000次Bootstrap分析所支持的概率，發育樹左下方標尺表示5%序列差異的分支長度.

　　4 討論

　　硝化過程是氮循環中生化機制中重要的一步，而氨氧化過程是硝化過程的第一步，古菌AOA和細菌AOB對氨氧化過程的相對貢獻率，是目前氮循環研究中的熱門問題.由于AOB在低溫條件下生長受到抑制，探索AOA在低溫條件下對氨氧化過程的貢獻率具有重要的意義.在不同的濕地環境中，AOA和AOB的優勢地位各不相同.本文構建間歇流人工濕地在低溫條件下運行，由于濕地系統運行的影響因素很多，作用機理較復雜，所以主要從水力負荷和停留時間兩個變量進行控制，研究在不同運行條件下，濕地系統中古菌AOA和細菌AOB的變化.

　　在平均氣溫為5 ℃時，不同水力負荷下濕地系統對氨氮去除效率都很高，達98%以上，且濕地系統中氨氧化古菌和氨氧化細菌的amoA基因豐度都較高，這說明在5 ℃時并沒有抑制土壤中古菌AOA和細菌AOB的生長，但在不同的水力負荷下個濕地中AOA、AOB中amoA基因的豐度發生變化，并且在水力負荷為4.8 cm · d-1時還同時促進了古菌AOA和細菌AOB的生長，這說明合理的水力負荷有利于濕地系統中氨氧化微生物的富集.假設每個AOA細胞有1個拷貝的古菌amoA基因，每個AOB細胞有2.5個拷貝的細菌amoA基因，則可進一步計算由AOA和AOB共同作用下的比細胞硝化速率，范圍在0.04~0.06 fmol · cell-1 · d-1(以NH3計，下同)，這與以往研究的最低值0.2 fmol · cell-1 · d-1相比較低，這可能是由于進水氨氮濃度較低，濕地系統中氨氮負荷低，導致硝化速率潛勢較低.在本文中，由于濕地中投加活性污泥，檢測出的古菌AOA豐度較高，高于自然界中檢測到的豐度值，且在低溫條件下可能有部分AOA和AOB沒有參與進氨氧化過程中去.

　　在平均氣溫為-5 ℃時，停留時間為21 h時，氨氮的去除率最高為81%.濕地系統中AOA和AOB amoA基因的豐度明顯下降，低溫抑制了AOA和AOB的生長，但AOA豐度仍高于AOB 2.9~32.8倍，且土壤的硝化速率潛勢并沒有降低，可能由于低溫抑制了AOA部分種群的生長，而剩余部分在這個運行條件下比較完全的參與了氨氧化的過程，所以氨氮去除率較高.在停留時間最短時，AOA中amoA基因的豐度減少最少，可能較短的水力停留時間有利于AOA的生長，但不利于土壤對氨氮的吸附沉淀作用，所以氨氮去除率很低.由圖 3可知，AOA/AOB豐度的比值和土壤硝化速率呈正相關，在比值小于10時，氨氮去除率較高，當比值大于30時，氨氮去除效率最低，是否在AOA主導的環境中，AOA和AOB豐度的合理比值能增強土壤系統中的氨氮去除率，還需進一步實驗證明.且在-5 ℃時，濕地系統中的古菌和細菌的比細胞硝化速率活性增加到0.19~1.5 fmol · cell-1 · d-1，并在氨氮去除率最高時，比細胞速率最高為1.5 fmol · cell-1 · d-1.與Sims等(2012)對自然濕地的比細胞速率值相比較低，與Santoro等(2010)對加利福尼亞海流中部的比細胞硝化速率的研究的結果：0.2~15.0 fmol · cell-1 · d-1相比較一致.

　　在不同水力負荷和不同停留時間運行時，AOA豐度都高于AOB，這與報道的認為在低溫、低氨氮濃度(2.5~13.5 mg · L-1)時AOA豐度較高，比AOB生長的更好的結果相一致，且和硝化速率呈正向變化趨勢，說明在低溫、低氨氮這種極端環境下，AOA比AOB在氨氧化過程中更具有競爭優勢.

　　本文對夏季和冬季-5 ℃樣品中的氨氧化古菌生物多樣性進行比較.在低溫低氨氮環境下運行后的AOA多樣性產生了明顯的季節性差異，夏季樣品AOA分別含有8個OTU，冬季樣品含有13個OTU，具有較高的生物多樣性.符合已報道的在人工濕地和人工施肥的土壤中AOA的物種多樣性相對豐富，在天然濕地和野生土壤中AOA的多樣性明顯減少的說法.夏季樣品的AOA序列全部屬于土壤支系，且大多數與嗜溫菌相似度較高，這與濕地系統的運行溫度有很大關系;而冬季樣品中各OTU差異度較大，與夏季樣品相比多樣性增多，既有土壤支系的，還出現了近似于海洋水體分支的新種群，這可能與間歇式運行方式有關，在濕地系統中形成了人工消落帶，且低溫低氨氮的環境改變了濕地系統中AOA種群的結構，增加了土壤中AOA的多樣性.因此，推測在低溫條件下，濕地系統中AOA在氨氧化過程中起主導作用.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。

　　5 結論

　　1)冬季平均氣溫為5 ℃時，人工濕地宜采用表層布水管進水，水力停留時間21 h，水力負荷4.2 cm · d-1，氨氮去除率達99%;平均氣溫降為-5 ℃，宜采用中間布水管進水，水力停留時間為21 h，水力負荷3.6 cm · d-1，氨氮去除率達81%，去除效率穩定.

　　2)在低溫、低氨氮環境中，不同運行條件下的濕地系統中AOA豐度均高于AOB豐度(2.9~33.2倍)，且AOA豐度與土壤硝化速率呈正向變化趨勢，說明在這種環境下濕地系統氨氧化過程中AOA比AOB更具有優勢.

　　3)濕地系統中氨氧化古菌的生物多樣性具有季節性差異，在低溫低氨氮環境下，AOA的種群結構發生了變化，由夏季的8個OTU增加到了13個OTU，其中夏季樣品全部屬于土壤支系，冬季樣品11個OTU序列屬于土壤支系，2個OTU序列屬于海洋水體支系.夏季和冬季樣品中的氨氧化古菌均屬于一個新命名的古菌類群——奇古菌門.