1 引言
漆酶(EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶類，是重要的木質(zhì)素纖維降解酶之一，最初被發(fā)現(xiàn)于漆樹漆液中，隨后發(fā)現(xiàn)某些高等真菌也能分泌該酶.由于漆酶廣泛的底物專一性，因此，其具備許多重要的生物學(xué)功能：在高等植物中具有降解木質(zhì)部的功能;在大型真菌中與色素和子實(shí)體的形成及木質(zhì)素的降解和分生孢子的致病性有關(guān).染料廢水是含有染料的有色廢水，具有組成復(fù)雜、色度高、生物難降解等特點(diǎn)，已經(jīng)成為危害水環(huán)境的主要污染源.漆酶可以對染料(如活性藍(lán)19、RB亮藍(lán)等)進(jìn)行有效的脫色，因此，得到越來越多的關(guān)注和研究.根據(jù)染料結(jié)構(gòu)可將染料分為蒽醌類染料、偶氮類染料、靛藍(lán)類染料和三苯甲烷類染料等.蒽醌類染料可以作為漆酶的底物被直接氧化，但有時(shí)也需要介體系統(tǒng)才能進(jìn)行有效脫色.大多數(shù)偶氮類染料不能作為漆酶的直接底物，在漆酶/介體系統(tǒng)中，漆酶借助自由基反應(yīng)形成酚類化合物，無需破壞偶氮鍵，因此，避免了形成有毒的芳香胺，更有利于控制環(huán)境污染，提高脫色效率.靛藍(lán)類染料是芳香族的還原性染料，因此，具有穩(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu)，生物降解性較差，利用HBT、HOBT等介體系統(tǒng)也可以很好地完成脫色.部分三苯甲烷類染料可以在漆酶單獨(dú)作用下進(jìn)行脫色，但脫色時(shí)間比較長，加入介體后可以明顯提高脫色效率.由于介體價(jià)格昂貴，因此，尋找無介體的漆酶催化染料脫色體系，或?qū)ふ倚滦土畠r(jià)介體可以有效地降低染料廢水的處理成本.
本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一株出芽短梗霉白化突變株Aureobasidium pullulans UVMU3-1胞外液具有常溫(30 ℃，28.5 6 U · L-1)和高溫漆酶活性(75 ℃，36.5 U · L-1)，產(chǎn)酶能力優(yōu)于出發(fā)菌株A. pullulans NG.本研究對出芽短梗霉無色素突變株Aureobasidium pullulans UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并研究其分子量大小、熱穩(wěn)定性及對三苯甲烷類染料孔雀石綠和結(jié)晶紫的脫色作用，為該具有漆酶活性的物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ).
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 供試菌株
出芽短梗霉A.pullulans UVMU3-1為本課題組誘變獲得的白化突變株.
2.1.2 主要試劑
50 mmol · L-1 愈創(chuàng)木酚(2-甲氧基苯酚)溶液，pH=2.4 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH=8.0 Tris-HCl緩沖液，染料孔雀石綠(MG)、結(jié)晶紫(CV)為實(shí)驗(yàn)室分析純;其它試劑藥品也均為實(shí)驗(yàn)室分析純.
2.1.3 培養(yǎng)基
固體培養(yǎng)基(PDA)：去皮土豆200 g · L-1、葡萄糖20.0 g · L-1、瓊脂20.0 g · L-1，pH自然;基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(YND)：葡萄糖20.0 g · L-1、NaNO3 6.40 g · L-1、MgSO4 · 7H2O 0.50 g · L-1、酵母浸出粉0.20 g · L-1、KH2PO4 1 g · L-1，pH=6.0;優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蔗糖 66.5 g · L-1、NaNO3 32 g · L-1、NaCl 1.08 g · L-1、酵母浸粉 0.2 g · L-1、KH2PO4 1 g · L-1，pH=6.0.
2.2 方法
2.2.1 搖瓶培養(yǎng)
挑取活化后的單菌落接種至50 mL液體YND培養(yǎng)基上，置于28 ℃、180 r · min-1搖床上振蕩培養(yǎng)2 d作種子液，將種子液(OD560=5.0)按1 ∶ 100接種量接種于裝有50 mL YND液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于28 ℃、180 r · min-1水浴振蕩培養(yǎng)，7 d后收獲發(fā)酵液.
2.2.2 漆酶活性測定
將于28 ℃、180 r · min-1振蕩培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液于4 ℃、10000 r · min-1下離心15 min，棄去沉淀所得上清液即為粗酶液.將500 μL的粗酶液和3 mL pH=2.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液混合，于75 ℃(30 ℃)保溫10 min，然后加入500 μL 50 mmol · L-1愈創(chuàng)木酚啟動反應(yīng).反應(yīng)5 min后，用分光光度計(jì)測定在λ=465 nm處吸光值A(chǔ)465，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù).用500 μL蒸餾水代替粗酶液作為空白對照.
酶活力的定義為：每分鐘氧化1 μmol愈創(chuàng)木酚所需要的酶量即為1個(gè)活力單位(U).酶活性計(jì)算公式為：U= 106 /ε × V總 /V酶 × A465 /t ，其中，V總和V酶 分別代表漆酶酶活測定反應(yīng)體系的總體積及反應(yīng)添加的酶液體積(mL);ε為摩爾吸光系數(shù)(L · mol-1 · cm-1).愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)ε465=1.21×104 L · mol-1 · cm-1，則酶活U=132.23×A465.
2.2.3 單因素試驗(yàn)
碳源：在YND基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中以濃度為20 g · L-1的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、淀粉、甘露醇和體積比2%的甘油作為碳源，28 ℃、180 r · min-1恒溫培養(yǎng)6 d，取粗酶液測定酶活.
氮源：在YND基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加N元素終濃度為75.29 mmol · L-1的NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、NaNO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨為氮源，在28 ℃、180 r · min-1下恒溫培養(yǎng)6 d，取粗酶液測定酶活.
無機(jī)鹽：基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加NaCl、KCl、CaCl2、K2SO4、CuSO4、MnSO4、FeSO4 · H2O、ZnCl2、MgSO4 · 7H2O、Fe2(SO4)3，28 ℃、180 r · min-1恒溫培養(yǎng)6 d，取粗酶液測定酶活.
起始pH：調(diào)節(jié)基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的起始pH值，28 ℃、180 r · min-1下恒溫培養(yǎng)6 d，取粗酶液測定酶活.
2.2.4 正交試驗(yàn)
根據(jù)基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素、三水平、9組試驗(yàn)對YND基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化(表 1).
表1 四因素三水平正交表
2.2.5 最適酶液量
以酶活單位U · L-1代表酶濃度，分別加入酶液終濃度為4.5、6、7.5、9、10.5、12 U · L-1的酶液，對終濃度20 mg · L-1的孔雀石綠染料溶液進(jìn)行脫色，75 ℃水浴條件下反應(yīng)，以蒸餾水代替孔雀石綠溶液作為空白對照，每隔20 min取一次樣，測定孔雀石綠溶液OD618變化，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取平均值.
2.2.6 孔雀石綠脫色作用
可見分光光度計(jì)掃描測定孔雀石綠在618 nm處具有最大吸收峰值，根據(jù)OD618值變化計(jì)算漆酶對孔雀石綠染料的脫色率.反應(yīng)體系體積為4 mL，其中包括500 μL 孔雀石綠溶液，然后加入到3 mL pH=2.4的檸檬酸緩沖液中，使染料初始濃度達(dá)到20 mg · L-1，再加入500 μL粗酶液，酶液終濃度為7.5 U · L-1，以蒸餾水代替孔雀石綠溶液作為空白對照.兩組試驗(yàn)分別測定常溫和高溫條件下胞外漆酶活性物質(zhì)對孔雀石綠染料的脫色，常溫組在30 ℃條件下反應(yīng)，高溫組在75 ℃水浴條件下反應(yīng)，每隔5 min取一次樣品，測定OD618變化，按公式(1)換算脫色率(D)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取平均值.
式中，A0為初始溶液的吸光度，A 為反應(yīng)后溶液的吸光度.
2.2.7 結(jié)晶紫脫色作用
結(jié)晶紫初始濃度達(dá)到20 mg · L-1，測定OD557變化，反應(yīng)體系和脫色率計(jì)算方法同2.2.6節(jié).
2.2.8 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)耐熱性
對28 ℃、180 r · min-1搖瓶培養(yǎng)7 d的UVMU3-1胞外粗酶液進(jìn)行提取，將4 mL粗酶液置于10 mL離心管中，100 ℃沸水浴中分別煮沸15 min和30 min后吸取酶液測定酶活，以原粗酶液酶活作為100%，比較煮沸處理后樣品的酶活，算出相對酶活，確定漆酶活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取平均值.
2.2.9 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)分子量確定
對28 ℃、180 r · min-1搖瓶培養(yǎng)7 d的UVMU3-1胞外粗酶液進(jìn)行提取，取適量酶液放入截留量分別為10000、8000、6000~8000、3500、2000、1000、500~1000、100~500 D的透析袋中，再將透析袋放入10倍體積pH=8.0的Tris-HCl緩沖液中，常溫放置6 h后吸取透析袋內(nèi)液與外液測定酶活，以原粗酶液酶活作為100%，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取平均值.
3 結(jié)果
3.1 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)培養(yǎng)基優(yōu)化 3.1.1 碳源對UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)的影響
在YND基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中以濃度為20 g · L-1的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、淀粉、甘露醇和體積比2%的甘油為碳源，28 ℃、180 r · min-1恒溫培養(yǎng)6 d，取粗酶液測定酶活.如圖 1a所示，蔗糖為碳源時(shí)產(chǎn)漆酶活力最高，達(dá)到21.95 U · L-1，因此，確定蔗糖為最佳碳源.蔗糖濃度為57.00 g · L-1時(shí)酶活最高，達(dá)到39.58 U · L-1(圖 1b)，因此，設(shè)置47.50、57.00、66.50 g · L-1為正交試驗(yàn)蔗糖水平.
圖1 碳源對UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)的影響(a.不同碳源；b.蔗糖濃度)
3.1.2 氮源對UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)的影響
在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、NaNO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨，發(fā)現(xiàn)UVMU3-1利用NaNO3產(chǎn)漆酶活力最高(38.35 U · L-1)，因此，將最佳氮源確定為NaNO3(圖 2a).NaNO3濃度為38.40 g · L-1時(shí)酶活最高，達(dá)到55.76 U · L-1(圖 2b )，故設(shè)置正交試驗(yàn)NaNO3水平為32.00、38.40、44.80 g · L-1.
圖2 氮源對UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)的影響(a.不同氮源；b.NaNO3濃度)
3.1.3 無機(jī)鹽對UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)的影響
UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)酶活結(jié)果顯示，CuSO4、FeSO4 · H2O、ZnCl2、MgSO4 · 7H2O、Fe2(SO4)3會抑制漆酶活性物質(zhì)產(chǎn)生和分泌，K2SO4及MnSO4對漆酶活性無明顯影響.NaCl、CaCl2、KCl對UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)均有明顯的促進(jìn)作用，其中以NaCl作為無機(jī)鹽時(shí)UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)的酶活力最高(49.28 U · L-1)，為UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外 漆酶活性物質(zhì)培養(yǎng)基最佳無機(jī)鹽(圖 3a).當(dāng)NaCl濃度為1.20 g · L-1時(shí)，酶活最高可達(dá)到55.89 U · L-1(圖 3b)，后續(xù)試驗(yàn)設(shè)置1.08、1.20、1.32 g · L-1為正交試驗(yàn)NaCl的3個(gè)水平.
圖3 無機(jī)鹽對UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)的影響(a.不同無機(jī)鹽；b. NaCl濃度)
3.1.4 初始pH對UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)的影響
調(diào)節(jié)基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值，28 ℃、180 r · min-1下恒溫培養(yǎng)6 d，取粗酶液測定酶活，結(jié)果如圖 4所示.初始pH為7.0時(shí)UVMU3-1產(chǎn)漆酶活力最高，達(dá)到51.48 U · L-1.因此，設(shè)置起始pH為6.0、7.0、8.0為正交試驗(yàn)起始pH值水平.
圖4 起始pH對UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)的影響
3.1.5 正交試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化
正交試驗(yàn)結(jié)果表明，UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)最優(yōu)水平組合為A3B2C1D1，即蔗糖66.50 g · L-1，NaNO3 38.40 g · L-1，NaCl 1.08 g · L-1，起始pH=6.0.極差分析比較發(fā)現(xiàn)，RD>RA>RC>RB，影響UVMU3-1菌株產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)能力的因素強(qiáng)弱依次為：起始pH>蔗糖>NaCl>NaNO3(表 2).
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果
3.1.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化后UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)酶活曲線
以優(yōu)化前后的培養(yǎng)基在相同條件下對UVMU3-1進(jìn)行培養(yǎng)，測定酶活隨時(shí)間變化曲線，結(jié)果見圖 5.優(yōu)化后UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)周期顯著提前，第3 d酶活出現(xiàn)高峰值，達(dá)到57.92 U · L-1，同時(shí)，酶活隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，培養(yǎng)7 d時(shí)酶活達(dá)到94.81 U · L-1
圖5 UVMU3-1高溫酶活曲線
3.2 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)對三苯甲烷類染料脫色作用
3.2.1 酶濃度對脫色效果的影響
酶濃度與孔雀石綠脫色效果呈正向關(guān)系，酶濃度越高對其脫色效果越好，但當(dāng)酶濃度達(dá)到7.5 U · L-1以上時(shí)，脫色效果差別不顯著(圖 6)，因此，選取酶濃度為7.5 U · L-1研究胞外耐熱性漆酶活性物質(zhì)對三苯甲烷類染料脫色作用.
圖6 不同酶濃度對孔雀石綠脫色效果
3.2.2 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)對三苯甲烷類染料脫色作用
粗酶液對孔雀石綠具有良好的脫色效果，7.5 U · L-1粗酶液與20 mg · L-1孔雀石綠在75 ℃反應(yīng)5 min后，脫色率為76.3%，反應(yīng)35 min后達(dá)到96.3%;而常溫條件下，反應(yīng)35 min后脫色率僅達(dá)到23.2%(圖 7 a).7.5 U · L-1粗酶液與20 mg · L-1結(jié)晶紫75 ℃反應(yīng)5 min后脫色率為77.5%;反應(yīng)35 min后達(dá)到95.3%，是常溫脫色率的8.9倍(圖 7b ).
圖7 UVMU3-1胞外耐熱性漆酶活性物質(zhì)對三苯甲烷類染料脫色作用(a.孔雀石綠；b.結(jié)晶紫)
3.3 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)性質(zhì) 3.3.1 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性
如圖 8所示，將粗酶液沸水浴中煮沸15 min后高溫酶活殘留92.33%，煮沸30 min后高溫酶活殘留72.50%，結(jié)果說明，該耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)具有良好的耐熱性.
圖8 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性
3.3.2 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)分子量
如圖 9所示，使用截留量大于1000 D透析袋時(shí)，酶活90%存在于透析外液，透析內(nèi)液幾乎沒有;當(dāng)透析袋截留量為1000、500~1000、100~500 D時(shí)，透析內(nèi)液出現(xiàn)酶活，但透析外液的酶活依然占到85%左右，結(jié)果說明該高溫漆酶分子量小于1000 D，在0~1000 D之間.
圖9 UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)分子量
4 討論
Maalej-Kammoun等(2009)在研究中指出，使用栓菌漆酶對孔雀石綠脫色2 h后，脫色率為80%.從子囊菌Paraconiothyrium variabile中提取漆酶PvL，并研究了該耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)對孔雀石綠染料溶液脫色效果，發(fā)現(xiàn)在酶濃度4 U · mL-1時(shí)，常溫條件下反應(yīng)15 min后，脫色率達(dá)到68%，1 h后脫色率達(dá)到85%.UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)對三苯甲烷類染料在高溫條件下的脫色效果優(yōu)于現(xiàn)有文獻(xiàn)道過的真菌胞外漆酶.并且由于三苯甲烷類染料不是漆酶的直接反應(yīng)底物，大多數(shù)情況下需要添加某種介體才能達(dá)到不錯的脫色效果.同時(shí)，介體價(jià)格往往是比較昂貴的，這就大大提高了工業(yè)化脫色成本.但UVMU3-1產(chǎn)耐熱性胞外漆酶活性物質(zhì)對孔雀石綠和結(jié)晶紫進(jìn)行脫色時(shí)沒有添加任何一種介體，同時(shí)，在高溫短時(shí)間內(nèi)可以對孔雀石綠和結(jié)晶紫幾乎完全脫色，這樣就降低了脫色成本，使其更具有工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值.
真菌漆酶對孔雀石綠或結(jié)晶紫等三苯甲烷類染料的脫色機(jī)理及脫色產(chǎn)物，到目前為止還沒有一個(gè)準(zhǔn)確完整的定論.利用HPLC和HPLC-MS在絲狀真菌Cunninghamella elegan ATCC36112漆酶降解孔雀綠的反應(yīng)物中，只檢測到孔雀綠和無色孔雀綠依次去甲基后的脫色反應(yīng)產(chǎn)物(圖 10).國外有研究表明(Papinutti et al., 2004)，當(dāng)孔雀綠分子側(cè)鏈上的甲基被破壞時(shí)，其在可見光的最大波長發(fā)生紅移，孔雀石綠的溶液從綠色變成淺藍(lán)色.其它研究報(bào)道表明，環(huán)境中的自由基可介導(dǎo)結(jié)晶紫的聚合;而劉友勛等(2008)的研究指出，孔雀石綠和結(jié)晶紫結(jié)構(gòu)類似，同屬于三苯甲烷染料，可能漆酶介體系統(tǒng)對孔雀石綠的作用機(jī)制類似：漆酶氧化介體形成介體自由基，在自由基的介導(dǎo)作用下孔雀綠被聚合成黑色沉淀物，最后導(dǎo)致孔雀石綠溶液由綠色逐漸變成無色.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
圖10 絲狀真菌Cunninghamella elegan ATCC36112漆酶降解孔雀綠的代謝途徑
