1 引言
目前，我國河流普遍受到污染.排放到水體中的污染物可通過沉積、沉淀等作用在底泥中積累，使得底泥成為一個微生物種類豐富、物質交換頻繁的復雜環境.環境條件的改變亦能直接或間接地改變微生物的群落結構;而微生物亦能通過同化、異化作用對底泥中的污染物進行降解從而改變區域環境條件.細菌和古菌是微生物的重要組成部分，能參與到碳、氮、硫等元素的循環過程中，對促進底泥中污染物的分解、減少污染積累、維持良好水質具有重大的作用.目前，關于水環境中微生物群落結構及其環境因子耦合關系的研究已經成為熱點，但多集中在湖泊與海洋等環境中，涉及江河的較少，特別是關于底泥中細菌與古菌群落結構對比的研究更是鮮見報道.
渾河作為遼河流域最重要的支流之一，是沿岸城市重要的地下水補給水源.以沈陽為例，其在渾河的取水量占全市取水總量的3/4;而位于上游撫順市的大伙房水庫，是遼寧省最大的人造蓄水水庫，并作為沈陽、撫順、盤錦等城市的重要飲用水源地.由于傳統重工業的發展和人口數量的劇增，大量的工業廢水和生活污水排放到渾河中，致使渾河流域尤其是下游水質遭受污染.目前，關于渾河的研究集中于氮、磷等污染物，以及重金屬和藻類等.
因此，本文利用PCR-DGGE技術考察渾河表層底泥中細菌與古菌的多樣性與群落結構情況，并通過相關性分析方法來研究微生物多樣性與水環境因子間的關系，以期更為深入地掌握河流底泥微生物的分布特征，為河流生態系統的生物法修復提供科學依據.
2 材料與方法
2.1 研究區域與采樣點的設置
渾河是遼河流域最重要的支流之一，河流全長約415 km，位于遼寧省東部(122°20′~125°20′E，41°00′~42°20′N)，發源于長白山支脈滾馬嶺西側，流經清原、撫順、沈陽、遼中、鞍山等市，并在海城市與太子河匯合后經大遼河由營口注入渤海灣.根據渾河的自然條件，本研究共設置了14個采樣點，其中，干流共設置9個采樣點，并分別在社河、章黨河、撫西河、白塔堡河、細河5條主要支流匯入干流處設置采樣點，具體分布見圖 1.
圖1 采樣地點示意圖(采樣點：1: 南雜木；2: 社河入渾口；3: 章黨大橋；4: 章黨河入渾口；5: 撫西河入渾口；6: 葛布大橋；7: 高坎大橋；8: 白塔堡河入渾口；9: 黃臘坨；10: 細河入渾口；11: 于家房；12: 對坨；13: 三岔河大橋；14: 田莊臺)
2.2 樣品采集與分析
于2013年11月下旬，采集水樣和底泥樣品.水樣采集：用不銹鋼采水器采集水樣，采集深度約在底泥上方2 cm處，水樣保存在500 mL聚乙烯采樣瓶中，放入帶有冰塊的保溫箱，運回實驗室儲存于4 ℃冰箱內;底泥采集：用滅菌的柱狀采泥器采集表層底泥(0~10 cm)，樣品采集后置于無菌自封袋中，置于干冰上運回實驗室，于-80 ℃冰箱中保存.
使用便攜式水質測定儀(Thermo Orion Star，賽默飛世爾科技有限公司)現場測定水溫、pH和溶解氧(DO).于實驗室內，按照文獻方法測定以下主要水質污染指標：五日生化需氧量(BOD5)、總磷(TP)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、亞硝氮(NO2--N)和葉綠素(Chl-a).
2.3 DNA的提取和聚合酶鏈式反應(PCR)
使用 Power Soil DNA Kit(Mo Bio Laboratories，Carlsbad，CA)對渾河底泥樣品進行總DNA的提取，提取結果經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.
采用巢式PCR對底泥樣品中細菌和古菌的16S rRNA基因進行擴增，兩輪擴增產物作為后續變性梯度凝膠電泳(DGGE)的上樣樣品.對于細菌，第一輪引物為27F和1492R，第二輪引物為357F和518R.第一輪反應條件為：95 ℃預變性2 min;95 ℃變性1 min，53 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min，循環30次;最后72 ℃延伸10 min.第二輪反應除退火溫度為55 ℃外，其它條件同第一輪反應.對于古菌，第一輪引物為PRA46F和PREA1100R，第二輪引物為PARCH 340F和PARCH 519R.第一輪反應條件為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性l min，65~55 ℃退火50 s，每個循環溫度降低0.5 ℃，72 ℃延伸1.5 min，循環20次，然后在55 ℃的退火溫度下繼續擴增，循環15次;最后72 ℃延伸7 min.第二輪反應除退火溫度先為63~53 ℃循環20次、后為53 ℃循環15次外，其它條件同第一輪反應.
以上擴增體系均為50 μL，包括：2×PCR GoTaqGreen Master Mix(Promega，USA)25 μL，上下引物各1 μL(10μmol · L-1)，DNA模版2μL(1~10 ng)，最后用ddH2O補足至50 μL.為保證基因片段的穩定遷移、提高DGGE的分辨效率，分別在上游引物357F和PARCH 340F的5′ 端添加一個長度為40 bp的GC夾.
2.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)
使用美國Bio-Rad公司的D-Code電泳系統進行變性梯度凝膠電泳.DGGE上樣樣品分別為細菌和古菌第二輪帶GC夾引物擴增的產物，每條泳道的上樣量均為25 μL.聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(丙烯酰胺 ∶ 甲叉丙烯酰胺=37.5 ∶ 1)，細菌與古菌變性劑濃度梯度范圍分別為40%~60%和20%~50%.在1×TAE緩沖液中，恒定溫度60 ℃、恒定電壓70 V的條件下，電泳15 h.用SYBR gold(Invirogen，USA)核酸染料染色30 min后，拍照分析.
各采樣點細菌和古菌的香濃-威爾多樣性指數(Shannon-Wiener Index，H′)、種群豐度(Richness，R)及均勻度(Evenness Index，E)均通過Quantity One(Bio-Rad，USA)軟件來計算電泳條帶的遷移率灰度條帶數量得到，具體為：
式中，pi指一種特定菌群相對總菌群的比率，pi=ni/N，ni為第i條條帶的強度，N為所有條帶強度之和，S為每條泳道DGGE條帶的數目.
采用非加權成對算數平均法UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean)對DGGE指紋圖譜進行聚類分析，研究各采樣點間的相似性.
2.5 數據統計與分析
將DGGE圖譜條帶的位置和亮度分別類比于物種的種類和數量，利用Canoco for windows 4.5軟件分別對細菌和古菌的DGGE圖譜條帶的數字化結果進行DCA分析，得到樣品矩陣第一軸的最大梯度長度均小于3，因此，選用冗余梯度分析方法(RDA)來分別計算環境因子與細菌、古菌群落組成變化的相關性.
3 結果與討論
3.1 水樣的理化指標
各采樣點水質的理化指標見表 1.由表 1可知，渾河上覆水水質均呈弱堿性.各采樣點水中溶解氧(DO)濃度變化范圍不大，除沈陽段的兩大支流白塔堡河與細河在渾河的匯入口外，其余采樣點濃度均大于10 mg · L-1.葉綠素(Chl-a)濃度變化趨勢較為明顯，從上游到下游濃度明顯增大，特別是在沈陽市下游地區，各個采樣點的葉綠素(Chl-a)的濃度值均大于80 mg · L-1，最大值達180.93 mg · L-1.分析其原因可能是因為下游地區多為農村地帶，來自農村生活污水和農業面源的氮、磷等營養物增多，導致藻類大量繁殖.
表1 水質理化指標
3.2 細菌與古菌的DGGE圖譜分析
3.2.1 細菌群落結構分析
渾河底泥樣品中細菌DGGE的指紋圖譜如圖 2所示.可以看出，上游底泥樣品中條帶數量要明顯小于下游樣品，說明上游底泥中細菌種類與下游相比較少;且上游樣品中條帶亮度較為平均，說明其優勢菌種并不明顯，而中、下游樣品中的部分條帶，如條帶3、4、6、7、8、9和10的亮度相對于其它條帶明顯較大，說明這些條帶所代表的細菌在下游采樣點中相對于其它菌種數量較多.
圖2 細菌的DGGE分析圖譜
聚類分析結果如圖 3所示，可知14個底泥樣品中細菌群落大致可分為4個大簇.其中，章黨大橋(3#)與其它樣品的差異較為明顯，這可能與其周邊的啤酒廠有關.由于啤酒廢水成分與其它排放到渾河的污水成分差異較大，久而久之，排放到該采樣點水體中的污染物質不斷沉積到底泥中，導致底泥中的細菌群落結構發生顯著的變化;其它底泥樣品的細菌群落在系統樹上明顯分成3個大簇，結合實際的地理位置分析，可分為3段：①鄉村段：上游采樣點南雜木(1#)與社河(2#)為一大簇，兩者皆在大伙房水庫上游，其間人口密度小，沒有大型工廠等污染源，水中污染物濃度相對下游河段較低;②城市段：中游采樣點章黨河(4#)至高坎大橋(7#)為一大簇，其采樣點分布在渾河的撫順市至沈陽市段部分，受城市生活污水和工業廢水影響較大;③城鎮段：下游采樣點白塔堡河(8#)至田莊臺(14#)為一大簇，其間沒有大城市，流經的地點多為小城鎮或鄉村，污染物主要源自于農村生活污水和農業面源.各個大簇內又可細分為更小的相似性族群，而空間上相鄰的兩采樣點底泥的總細菌群落結構的相似性一般較高.
圖3 細菌DGGE圖譜聚類(UPGMA)分析
分析上述現象產生的原因可能是因為處于城市地區的河段，由于城市生產、生活廢水的大量排放，超過了其自凈能力，致使污染物沉積到底泥中，改變了原有系統的營養物循環.而環境條件的改變又導致底泥中一些土著細菌因不能適應環境的改變而遭到淘汰，而另一些能夠適應新環境的細菌大量繁殖，破壞了底泥中原有的細菌群落結構平衡;相反，鄉村地區河流由于受人為因素的干擾較小，底泥細菌群落也明顯不同于城市河流段.
總體上，渾河底泥樣品中的細菌群落結構出現了較為明顯的分區特征，這與關于松花江底泥中細菌群落分布的研究結果明顯不同.研究發現，松花江底泥中的細菌群落分布不存在明顯的地域分區現象，部分不相鄰的采樣點反而具有較高的群落相似度.他認為之所以發生上述現象可能是由于松花江相鄰兩采樣點之間并沒有嚴格的分界線，細菌可以四處遷徙，因此，分區現象不明顯.而渾河上、中、下游3段的采樣點間水質逐漸變化，各段內水質情況較為類似，導致其底泥中細菌群落結構亦呈現逐漸演替的趨勢，因此，分區現象明顯.
底泥樣品細菌的多樣性指數、種群豐度及均勻度見表 2.從渾河上游至下游，細菌群落的多樣性指數和種群豐度總體均呈現先逐漸上升再逐漸下降的趨勢，且分別在白塔堡河處達到最大值3.88和4.54.說明從上游至下游，渾河底泥中細菌群落多樣性先增加再降低，群落中優勢微生物所占比重加大.
表2 底泥樣品細菌與古菌的多樣性指數、種群豐度及均勻度
3.2.2 古菌群落結構分析
渾河底泥樣品中古菌的DGGE指紋圖譜如圖 4所示，可看出上游和下游底泥樣品中古菌的條帶數量要小于中游底泥樣品的條帶數，說明上游和下游底泥中古菌種類較中游少.總體來說，14個采樣點中較亮的條帶并不多，只有位于下游的采樣點對坨(12#)存在6條相對較亮的條帶，說明渾河底泥中古菌并不像細菌那樣存在某些數量相對其它菌種較多的菌種，而是各菌種數量相差不大.
圖4 古菌的DGGE分析圖譜
聚類分析結果如圖 5所示，可知14個底泥樣品中古菌群落大致可分為2個大簇：位于下游的采樣點黃臘坨(9#)、細河(10#)和對坨(12#)為一大簇，其余采樣點為另一大簇.可見，渾河底泥中古菌的群落結構分布與細菌大不相同，并不具有明顯的地域分區特征，如位于上游的采樣點南雜木(1#)和位于下游的采樣點于家房(11#)在空間上并不相鄰，但二者卻具有較高的相似度.
圖5 古菌DGGE圖譜聚類(UPGMA)分析
渾河底泥樣品中古菌的多樣性指數、種群豐度及均勻度見表 2.與細菌相同，古菌的多樣性指數和種群豐度總體也呈現出先逐漸上升再逐漸下降的趨勢，且分別在白塔堡河處達到其最大值2.91和2.05.說明從上游至下游底泥中古菌群落結構的變化情況與細菌一致，也是由簡單變為復雜再變為簡單.
3.4 細菌和古菌的種群結構與水環境因子的相關性
運用冗余梯度分析(RDA)，將細菌DGGE圖譜的數字化結果和水樣理化指標結合在一起分析，結果概括于表 3，排序結果如圖 6a所示.可知，第一軸(λ=0.171)和第二軸(λ=0.131)揭示了50.9%的信息量，而4個軸總共揭示了78.2%的屬種數據變化.第一軸與硝氮(NO3--N)和亞硝氮(NO2--N)的相關系數較高，分別為-0.6751和-0.7645，而第二軸與pH和葉綠素(Chl-a)的相關系數較高，分別為0.7494和0.6550.說明底泥中的細菌群落結構主要與水中的NO3--N、NO2--N、pH和Chl-a相關.
表3 環境因子與細菌群落和古菌群落的RDA結果
圖 6為基于古菌DGGE圖譜的樣品與理化因子的 RDA排序圖，結合表 3可知，圖中前4個軸揭示了74.5%的信息量，其中，第一軸(λ=0.207)和第二軸(λ=0.112)揭示了49.5%的信息量;在古菌種類與環境因子之間的相關系數中，軸1(r=0.985)和軸2(r=0.976)的相關性都很高.第一軸與氨氮(NH4+-N)和葉綠素(Chl-a)的相關系數較高，分別為0.5788和0.4893，而第二軸與總磷(TP)和硝氮(NO3--N)的相關系數較高，分別為-0.3702和-0.3321.說明底泥中古菌群落結構主要與水中的NH4+-N、Chl-a、TP和NO3--N相關.
圖6 基于細菌(a)和古菌(b)DGGE圖譜的樣品與環境因子的 RDA排序圖
4 結論
1)從上游至下游，渾河底泥中細菌與古菌的群落結構均由簡單變為復雜，其Shannon多樣性指數總體均呈現先逐漸增大再逐漸減小的趨勢，變化范圍分別為3.00~3.88和2.10~2.91.
2)渾河底泥中具有豐富多樣的細菌種類，而古菌種類則相對較少，所有采樣點底泥中細菌的Shannon多樣指數和種群豐度R均大于同一地點底泥中古菌的Shannon多樣指數和種群豐度R，說明細菌是渾河表層底泥中的主要存在的微生物.
3)渾河底泥樣品中細菌群落結構出現了較為明顯的地域分區特征，鄉村段、城市段和城鎮段河流的相鄰采樣點間的群落結構較為相似，而古菌群落結構則不具有明顯的地域分區特征.
4)渾河底泥中細菌群落與上覆水中NO3--N、NO2--N、pH和Chl-a有明顯相關性，而古菌群落則與NH4+-N、Chl-a、TP和NO3--N有明顯相關性.具體參見污水寶商城資料或http://www.bnynw.com更多相關技術文檔。
5 建議
RDA分析結果表明，NO3--N、NO2--N、NH4+-N、TP、Chl-a和pH是影響渾河底泥中細菌與古菌群落的主要因素，其中，Chl-a含量較高亦是因N、P物質較多而引起水體富營養化的結果.因此，控制和減少水中N、P等營養物質的含量是渾河修復治理過程中的重要問題之一.可通過人工投加微生物的方法來減少水中N、P等污染物的含量.如采用固定化氮循環細菌技術，即從渾河底泥中提取天然無害的氮循環細菌，進行馴化，然后為之提供生存載體.同時，應加大污染控制力度，提高污水處理能力，各部門積極配合，全面綜合治理渾河水質，才能使之得以全面改善.
